[发明专利]一种马铃薯卷叶病毒PLRV的反转录环介导等温扩增RT-LAMP检测试剂

说明书

本发明属于生物检测技术领域，提供了一组新的马铃薯卷叶病毒（PLRV）的RT‑LAMP检测的特异性引物，在此基础上建立了马铃薯卷叶病毒（PLRV）的RT‑LAMP检测试剂。本发明的RT‑LAMP检测试剂及检测体系，能快速、高效、高特异、高灵敏地检测马铃薯卷叶病毒（PLRV），其成本低、准确且快速，在实际检测中展示出良好的应用前景，能很好满足目前对该病毒诊断和检测的迫切需要，用于基层单位、田间和进出口等的现场检测，易于大范围推广应用。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种马铃薯卷叶病毒PLRV的反转录环介导等温扩增RT-LAMP检测试剂。

背景技术

马铃薯(Solanum tuberosum)是世界第四大粮食作物。病毒病是引起马铃薯退化的主要原因。马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)是一种单链正义的RNA病毒，属黄花病毒组，侵染马铃薯，引起叶片卷曲，叶肉革质化，叶色黄化，植株矮化等症状，是严重影响马铃薯产量与品质的主要病毒之一，给马铃薯产业造成巨大损失。我国国家标准(GB18133马铃薯种薯)和行业标准(NY/T 1212-2006马铃薯脱毒种薯繁育技术规程)将马铃薯卷叶病毒列为马铃薯种薯上包括马铃薯X病毒PVX、马铃薯Y病毒PVY、马铃薯S病毒PVS、马铃薯A病毒PVA和马铃薯M病毒PVM等在内的必须剔除的6种病毒病之一。

病毒检测是马铃薯病毒病害防治、预测预报、脱毒种薯(苗)培育等过程中的一个重要环节。马铃薯卷叶病毒PLRV检测主要有ELISA、普通RT-PCR、多重RT-PCR、real-timeRT-PCR、基因芯片亦称为DNA微点阵(DNA microarray)等方法。ELISA法虽然高通量，但程序繁杂、耗费时间、又灵敏度较低；而RT-PCR、多重RT-PCR和real-time RT-PCR核酸检测技术虽然具有灵敏度和特异性高以及多同步性等优点，但仪器昂贵、成本高、耗时长，正是由于技术难度和成本问题，仅局限于试验室，难于在生产实际中推广应用。环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是日本的荣研株式会社的Notomi等人于2000年开发的一种新型的核酸扩增分子检测技术，该技术针对靶基因的6个特定区域设计4条特异性引物，在链置换DNA酶(Bst DNA polymerase)的作用下，在恒温(60-65℃左右)条件下快速对靶基因进行扩增，15～60min即可观察结果。LAMP具有特异性强、灵敏度高、产物易检测、操作简单、快速且适合于多种检测环境等优点，自开发以来，其作为一种分子生物学检测技术，被广泛应用于许多领域的基因检测。反转录环介导等温扩增(Reversetranscription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)技术在RNA植物病毒检测方面的应用亦有报道，表现出简便、快捷、准确的特点。有关马铃薯卷叶病毒PLRVRT-LAMP检测方法前人做了尝试性研究，但迄今作为一项成熟技术在生产上特别是田间现场应用还未见报道。为了RT-LAMP技术在马铃薯科研，特别是基层单位和生产一线的方便应用，需要建立简便、快捷、准确检测马铃薯卷叶病毒PLRV的RT-LAMP检测体系。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，针对PLRV现有检测技术之不足，本发明提供了一种效率高的马铃薯卷叶病毒PLRV的反转录环介导等温扩增RT-LAMP检测试剂。

本发明提供用于检测马铃薯卷叶病毒PLRV的反转录环介导等温扩增RT-LAMP引物组，所述引物组由以下引物组成：

上游内引物FIP：CATCGGATACGTCGTCAGACGG-AGGGACGAAACCCCGATAC；

下游内引物BIP：ACTGAGTCGCTGCGATTGGAG-TGGGCCAGTCTGTACCAT；

上游外引物F3：GGAAGGAAAACCGGTTGGAA；

下游外引物B3：GTTCAGGTGGGTGCCTTG；