[发明专利]一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：包括：样品结合垫、检测垫、吸样垫和底板，样品结合垫、检测垫和吸样垫依次设置在底板上，且样品结合垫和吸样垫分别叠压在检测垫的两端上，检测垫上设有四条检测线和一条质控线。

2.如权利要求1所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：其检测指标包括脑脊液中PCT、CRP、ESAT-6-CFP10抗原和隐球菌荚膜多糖抗原；样品结合垫内包被有时间分辨荧光微球标记的抗体，时间分辨荧光微球标记的抗体为检测指标的抗体。

3.如权利要求1所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：样品结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗ESAT-6-CFP10多克隆抗体和抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体。

4.如权利要求2或3所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：时间分辨荧光微球为修饰过的聚苯乙烯微球；聚苯乙烯微球表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，聚苯乙烯微球的粒径为100～500nm。

5.如权利要求2或3所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：时间分辨荧光微球内部填充有1wt％镧系元素的螯合物，镧系元素为铕、钐、鈊或镝中的一种。

6.如权利要求2或3所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：时间分辨荧光微球标记的方法为：包括顺序相接的如下步骤：

1)将时间分辨荧光微球溶于缓冲液中，加入活化剂恒温震荡活化；

2)将步骤1)所得的物料中加入有机溶剂，混匀后，离心、洗涤除去活化剂，用缓冲液重悬微球，随后分别加入抗PCT单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗ESAT-6-CFP10多克隆抗体及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，恒温震荡标记，离心后用复溶缓冲液重悬，加入封闭剂进行封闭，得到时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体复合物、抗CRP单克隆抗体复合物、抗ESAT-6-CFP10多克隆抗体复合物及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体复合物，用于PCT、CRP、ESAT-6-CFP10抗原以及隐球菌荚膜多糖抗原性能的评估。

7.如权利要求6所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：步骤1)和步骤2)中的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或/和N-羟基琥珀酰亚胺；步骤2)中，有机溶剂为体积浓度为10％的乙醇，复溶缓冲液包括Tris-Hcl、BSA、T-20、海藻糖和NaCl。

8.如权利要求2或3所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：四条检测线相互平行，四条检测线分别为能够与时间分辨荧光微球标记的抗体特异性结合的配对抗体所形成的涂层；四条检测线和一条质控线相互平行，且沿着检测垫的长度方向依次设置，从样品结合垫到吸样垫的方向上，依次是四条检测线和一条质控线；质控线包被有羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgY或羊抗兔IgG。

9.如权利要求1-3任意一项所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：检测垫包括2～4条检测分垫，四条检测线随机地分布在检测分垫上，每条检测分垫上均设有一条质控线，同一检测分垫上，质控线比检测线离吸样垫的端部近；检测垫为硝酸纤维素膜、且为孔径5～12um的多孔膜；样品结合垫的材质为玻璃纤维素膜或无纺布；吸样垫的材质为吸水滤纸。

10.权利要求1～9任意一项所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括顺序相接的如下步骤：

(1)检测垫的处理：

将检测垫贴在底板上，取含有1～5wt％蔗糖的10～50mM的pH7.4磷酸盐缓冲液将另一个表位的PCT单克隆抗体、CRP单克隆抗体、ESAT～6～CFP10多克隆抗体和隐球菌荚膜多糖单克隆抗体分别稀释至1±0.02mg/ml，用于制备四条检测线；用含有1～5wt％蔗糖的10～50mM的pH7.4磷酸缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1±0.02mg/ml，用于制备质控线；按1±0.02μl/cm划液量，通过biodot划膜仪将上述5种稀释后的抗体均匀得划至检测垫上制备检测线和质控线；将划好的检测垫放置于37±3℃干燥箱中，干燥3±0.2h；

(2)样品结合垫的处理：

样品结合垫用含有表面活性剂的缓冲液浸泡进行预封闭后，37±3℃干燥3h±0.2h；通过Biodot仪器的airjet喷头，将标记有时间分辨荧光微球的抗体按照5±0.02μl/cm的量超声喷雾至样品结合垫上，37±3℃干燥3h±0.2h，制备得到样品结合垫；

(3)组装：

将步骤(2)得到的样品结合垫固定叠压在步骤(1)得到的检测垫的一端，并将吸样垫固定叠压在检测垫的另一端，叠压长度均为1～4mm，用裁膜仪按每条4～6mm的宽度进行裁剪，即得可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条。