[发明专利]一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于滚环扩增介导催化发夹自组装和内切酶反馈放大方法检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器。该发明的检测方式是荧光法检测，利用荧光仪。在检测之前，先将挂锁探针和连接探针形成环形模板探针。然后将目标物加入到复合探针I、复合探针II和HP2、HP3的均相溶液，在37℃孵育120 min，目标物与适配体序列绑定。在phi29 DNA聚合酶和核酸内切酶IV作用下完成多倍数反馈放大过程，从而实现信号的放大。然后用荧光仪设置激发波长为399 nm，检测610 nm处荧光强度，检测范围为560 nm‑640 nm。同时本发明还提供了该生物传感器的制备方法，该方法反应条件温和，易于操作。

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于滚环扩增介导催化发夹自组装和内切酶反馈放大方法检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器，还涉及其制备方法。

背景技术

赭曲霉毒素（Ochratoxins，OT）是由曲霉菌、青霉菌等菌属产生的一类低分子量的次级代谢产物，属于真菌毒素组的天然污染物。其在农作物生产、加工、储存等过程中均能存在，其中，赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是毒性最强、分布最广的一类，20世纪60年代在南非的玉米粉中被发现。多项研究表明，OTA具有肾毒性、肝毒性、胚胎毒性、致畸形、神经毒性、免疫毒性、遗传毒性和致癌性。国际癌症研究机构（IARC）根据几项动物研究中发现的大量致癌性证据，将OTA列为可能的人类致癌物（2B类）。此外，联合国粮农组织（FAO）估计，世界上约有25%的谷物受到霉菌毒素的污染。

由于OTA具有痕量、剧毒、污染情形较复杂等特点，使实际检测存在较大难度，建立灵敏、高效的检测方法对于研究OTA的污染状况、有效降低其危害及制定各种实际样品中OTA的限量标准具有重要意义。

传统的检测OTA的方法主要有：光学分析法、电泳法、色谱法。但存在以下缺点：检测精度相对较低；检测时间较长，操作复杂；检测仪器昂贵，成本高。

发明内容

为了解决以上现有技术中检测赭曲霉毒素A（OTA）的方法特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的基于滚环扩增介导催化发夹自组装和内切酶反馈放大方法检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器。同时还提供了该荧光生物传感器的制备方法。

一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器，包括OTA适配体、目标物、复合探针I、复合探针II、HP2、HP3、phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP以及缓冲液；

所述复合探针I为OTA适配体、拱形探针与环形模板杂交而成；

所述复合探针II为环形模板与HP1杂交而成；

所述的环形模板探针由挂锁探针与连接探针形成；

所述的挂锁探针序列如SEQ No.1所示；

所述的连接探针序列如SEQ No.2所示；

所述的OTA适配体序列如SEQ No.3所示；

所述的拱形探针序列如SEQ No.4所示

所述的HP1序列如SEQ No.5所示；

所述的HP2序列如SEQ No.6所示；

所述的HP3序列如SEQ No.7所示。

所述的挂锁探针的5'端磷酸化。

所述的环形模板探针的制备工艺为：

S1 挂锁探针、连接探针在10×T4 DNA连接酶反应缓冲液中变性；所述的缓冲液为50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl₂，10 mM DTT，1 mM OTA，pH7.5；