[发明专利]一种植物多分体病毒载体的开发和应用

说明书

本发明公开了一种植物多分体病毒载体的开发和应用。本发明提供了成套重组病毒载体，包括表达BN1的重组载体和表达BN2的重组载体；所述表达BN1的重组载体为将BNYVV基因组的RNA1全长CDNA序列替换双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA1；所述表达BN2的重组载体为将BNYVV基因组的RNA2全长CDNA序列替换所述双元表达载体的多克隆位点间的DNA片段得到的载体，表达BNYVV病毒的RNA2。本发明采用的多分体病毒表达载体能在植物同一个细胞内同时表达多个蛋白；在植物体内表达量比较高，周期短，并且可以系统侵染。

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种植物多分体病毒载体的开发和应用。

背景技术

植物病毒载体开发的基本原理是利用反向遗传学，在植物病毒的侵染性克隆上寻找合适的位点插入或替换外源片段，随着重组病毒侵染寄主植物，外源基因得到大量地表达。与外源基因稳定表达的转基因系统相比，病毒载体周期较短，外源蛋白的表达量也较大，并且对于转基因操作困难的植物来说，病毒载体系统显得尤为重要。自1984年科学家首次利用花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)表达载体在植物上异源表达细菌基因以来(Brisson et al.,1984)，基于植物病毒改造开发的载体在重组蛋白的异源表达和植物功能基因组研究方面得到了广泛的应用(Palmer and Gleba,2014)。

目前，用于载体开发的植物病毒主要为单分体和双分体病毒，即含有一条或两条基因组核酸链。如属于烟草花叶病毒属(Tobamoviruses)(Takamatsu et al.,1987；Yusibovet al.,1999)，马铃薯X病毒属(Potexviruses)(Chapman et al.,1992；Baulcombeet al.,1995；Zhang et al.,2013)，马铃薯Y病毒属(Potyvirus)(Majeret al.,2015；Jarugula et al.,2016；Seoet al.,2016)和花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)(Brissonet al.,1984)等单分体病毒；属于线虫传多面体病毒属(Necrovirus)(Zhou et al.,2010)，真菌传杆状病毒属(Furovirus)和豇豆花叶病毒属(Comoviruses)(Sainsbury etal.,2008；Zhang et al.,2010)的双分体病毒。也有少数三分体病毒如大麦病毒属(Hordeivirus)(Yuan et al.,2011；Lee et al.,2012；Cheuk and Houde,2018)和雀麦花叶病毒属(Geminiviruses)(Stanley,1993)的成员也被开发为病毒载体。

BNYVV是正单链RNA病毒，典型的多分体病毒，含有4-5条基因组RNA。RNA1和2编码持家基因，RNA3、4和5编码病毒致病和介体传播相关的蛋白。在一些田间分离物或者病毒通过汁液摩擦继代接种时，RNA2、3、4和5的内部会发生片段的缺失，表明这些区域不是病毒复制所必须的，因此这些缺失区域可以改造为外源片段的插入位点。目前，欧洲的两个BNYVV分离物F-13和Yu2已被分别构建了T7和35S启动子下的全长cDNA侵染性克隆(Delbianco etal.,2013；Laufer et al.,2018a)，其中F-13分离物的RNA3和RNA5被改造开发成病毒表达载体，在昆诺黎和大果甜菜上异源表达GFP和RFP蛋白(Erhardt et al.,2000；Schmidlinet al.,2005；Alice et al.,2013；Delbianco et al.,2013；Laufer et al.,2018b)。BNYVV其他组分RNA还未见载体开发的报道。

甜菜一直是世界上一种重要的糖料、能源和饲用作物，并且近年来菜用甜菜由于其独特的营养成分也逐渐受到大众的青睐。尽管2014年已经测定了普通甜菜的全基因组序列(Dohm et al.,2014)，但因为甜菜转基因比较困难，目前其基因的生物学功能研究还未深入开展。因此，开发适用于甜菜的病毒的表达载体对甜菜基因功能的研究具有非常重要的意义。