[发明专利]一种牛丝氨酸苏氨酸激酶STK11干扰腺病毒的构建方法

说明书

本发明涉及一种牛丝氨酸苏氨酸激酶STK11干扰腺病毒构建方法，首先筛选干扰效率最高的shRNA序列，然后将该shRNA序列与干扰腺病毒载体重组，构建STK11干扰腺病毒；该STK11干扰腺病毒在秦川牛原代前脂肪细胞中进行侵染和干扰效率验证，结果表明侵染效果良好，STK11的表达在mRNA水平上降低76％，蛋白水平也呈显著性下降，可成功实现STK11基因在体细胞中的持续敲低，为今后开展STK11基因功能的相关研究提供了可靠的实验技术。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种牛丝氨酸苏氨酸激酶STK11干扰腺病毒的构建方法。

背景技术

丝氨酸苏氨酸激酶11(serine/threonine，kinase，STK11)，又称肝脏激酶B1(LKBl)，是激活磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)信号通路的关键上游蛋白分子，参与细胞极性、细胞分裂、细胞增殖、细胞分化、细胞代谢等多种细胞进程，主要通过磷酸化和亚细胞定位两种信号转导机制发挥作用。

研究表明，STK11-AMPK途径同时是影响脂肪组织和肌肉组织两大代谢器官的重要信号通路。在模式动物小鼠中的研究发现，敲除脂肪组织STK11基因影响白色脂肪组织和棕色脂肪组织的发育和功能(Shan，Xiong et al.，2016；Zhang,Wang，Song，&Zou，2013)，敲除骨骼肌STK11基因导致骨骼肌代谢紊乱，影响脂滴和脂肪酸氧化(Jeppesen等，2013)，增加葡萄糖稳态和胰岛素敏感性，并且条件性敲除小鼠STK11基因，促使脂肪组织在骨骼肌的异位沉积Shan T(2014)。据此，推测牛STK11基因可能参与牛肌肉-脂肪组织的对话机制并发挥重要的节点交互调控作用。

但是，牛作为一种大型家畜动物，基因敲除模型个体建立难度大，若以分离的原代目的细胞作为研究对象，一般的shRNA载体转染效率低、市面上合成的siRNA产品作用时效短，因此，研究牛丝氨酸苏氨酸激酶STK11干扰腺病毒，可实现在牛脂肪细胞和肌肉细胞中同时或独立持续敲低STK11基因的表达，为研究STK11基因功能奠定良好的技术基础。

以下是发明人给出的相关参考文献：

【1】Shan，T.，et al.，Lkb1controls brown adipose tissue growth andthermogenesis by regulating the intracellular localization of CRTC3.NatureCommunications，2016.7(1)。

【2】Jeppesen，J.，et al.，LKB1regulates lipid oxidation during exerciseindependently of AMPK.Diabetes，2013.62(5)：p.1490-9。

【3】Zhang，W.，et al.，Liver kinase b1is required for white adiposetissue growth and differentiation.Diabetes，2013.62(7)：p.2347-58。

【4】Shan，T.，et al.，Lkb1is indispensable for skeletal muscledevelopment，regeneration，and satellite cell homeostasis.Stem Cells，2014.32(11)：p.2893-907。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种牛丝氨酸苏氨酸激酶STK11干扰腺病毒构建方法，以获得STK11基因表达持续敲低的牛脂肪细胞或肌肉细胞研究模型。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：