[发明专利]赤眼鳟β-肌动蛋白基因cDNA全长序列、扩增引物及扩增方法

权利要求书

1.一种赤眼鳟β-肌动蛋白基因cDNA全长序列的扩增方法，其特征在于，从赤眼鳟肝脏中抽提总RNA，用Clontech公司SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒合成5′-RACE-Ready cDNA和3′-RACE-Ready cDNA，用Fermentas RevertAidTM First Strand cDNASynthesis Kit反转录试剂盒合成基因核心片段扩增所需cDNA第一链，根据已知鱼类的β-肌动蛋白核苷酸序列设计保守区域PCR扩增引物，根据克隆得到的赤眼鳟β-肌动蛋白的cDNA核心片段设计两个5’-RACE下游引物和两个3’-RACE上游引物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述赤眼鳟肝脏的采集步骤包括解剖采集赤眼鳟肝脏，剪成100mg左右大小分装样品管中，液氮速冻，-70℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述从赤眼鳟肝脏中抽提总RNA的步骤包括将研钵置于烤箱中180℃烘烤3-4小时然后冷却至室温再用液氮预冷，剪取液氮中保存的肝脏约100mg，加液氮研磨成粉末，反复研磨三次后加入总RNA提取液并匀浆；将匀浆液转移至DEPC处理离心管，12000r/min4℃离心10min，保留上清液，弃沉淀，上清室温放置5分后，加氯仿1mL，上下颠倒混匀15秒，室温放置5-10min，12000r/min4℃离心15min；此时离心管内分为三层，将最上层上清液移至新离心管，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min，12000r/min4℃离心10min；离心后弃上清，加入1mL DEPC水配制的75％的乙醇，悬浮沉淀，7500r/min4℃离心5min反复一次以彻底清洗；彻底去除乙醇，沉淀在室温下干燥30min左右，加20-30μL free-RNase的灭菌去离子水，55℃水浴溶解；再进行RNA浓度和纯度的检测。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述已知鱼类的β-肌动蛋白核苷酸序列设计保守区域PCR扩增引物为ACT01F:5’-TGGCATCACACCTTCTACAACGA-3’，ACT02R:5’-CCTTCATAGAGGCAAATAAGTTTCGG-3’，

以上述合成的基因核心片段扩增所需cDNA第一链为模板，分别以ACT01F，ACT02R为引物扩增赤眼鳟肝脏β肌动蛋白基因cDNA核心片段，用Taq DNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR扩增。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增条件为：94℃预变性5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸5min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两个5’-RACE下游引物分别为

MLACT5’03R:5’-GATTACGCCAAGCTTACATTGCCGTCACCTTCACCGTTCCAGT-3’；

MLACT5’04R：5’-GATTACGCCAAGCTTAGGCCAGGATGGAACCTCCGATCCAG-3’。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述5’-RACE首轮扩增用MLACT5’03R引物和试剂盒自带通用引物10*Universal Primer A Mix(UPM)对上述合成5′-RACE-Ready cDNA进行扩增，Touch down PCR反应条件为：94℃预变性5min，随之94℃1min，70℃1min，72℃1min，5个循环，94℃1min，68℃1min，72℃1min，5个循环，94℃1min，65℃1min，72℃1min，25个循环，最后72℃延伸5min。取以上扩增产物1μl为模板，用试剂盒提供的NestedUniversal Primer(NUP)引物和MLACT5’04R引物进行二次PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5min，94℃1min，57℃1min，72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸5min，获得基因cDNA5′端序列。