[发明专利]赤眼鳟β-肌动蛋白基因cDNA全长序列、扩增引物及扩增方法

说明书

本发明公开一种赤眼鳟β‑肌动蛋白基因cDNA全长序列的扩增方法，通过RT‑PCR技术和RACE法，从赤眼鳟肝脏中克隆获得了赤眼鳟β‑肌动蛋白基因cDNA全长序列，并利用软件对其进行氨基酸理化性质分析、信号肽预测、一级、二级、三级结构预测和同源性分析，为进一步研究该基因的结构和功能奠定基础，同时也为赤眼鳟其他功能基因的研究提供可靠的分子内标。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种赤眼鳟β-肌动蛋白基因cDNA全长克隆的方法。

背景技术

肌动蛋白广泛存在于真核生物中,是构成细胞骨架和肌小节的主要成分，几乎参与了真核细胞所有的生理过程，如维持细胞结构、细胞运动、细胞分裂等。根据等电点的不同，肌动蛋白可分为α、β、γ三种类型。

β-肌动蛋白基因具有mRNA的表达数量高，数量稳定的特点，在测定某种mRNA的表达量时，常采用β-肌动蛋白mRNA作为参照。β-肌动蛋白基因的启动子为强启动子，对于提高转基因表达量具有显著效果，且其表达不受组织的限制，这两大优点使得β-肌动蛋白基因启动子在转基因动物的研究中发挥着重要的作用。国内外对鳜鱼、黄鳝等物种的β-肌动蛋白的研究表明，β-肌动蛋白基因氨基酸编码区高度保守，各种生物间氨基酸序列的同源性高达70％以上。

赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)属硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科、赤眼鳟属,俗称野草鱼、红眼鱼。具有生长快、适应性强、商品鱼售价高等优点,其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富,深受消费者青睐,是江河主要优质经济鱼类之一,也是淡水养殖的热门种类。目前国内没有对赤眼鳟β-肌动蛋白基因cDNA的克隆和序列分析进行研究。

发明内容

本发明通过RT-PCR技术和RACE法，从赤眼鳟肝脏中克隆获得了赤眼鳟β-肌动蛋白基因cDNA全长序列，并利用软件对其进行氨基酸理化性质分析、信号肽预测、一级、二级、三级结构预测和同源性分析，为进一步研究该基因的结构和功能奠定基础，同时也为赤眼鳟其他功能基因的研究提供可靠的分子内标。

本发明的方面，公开了一种赤眼鳟β-肌动蛋白cDNA基因序列的扩增方法，其特征在于，从赤眼鳟肝脏中抽提总RNA，合成5′-RACE-Ready cDNA和3′-RACE-Ready cDNA，合成基因核心片段扩增所需cDNA第一链，根据已知鱼类的β-肌动蛋白核苷酸序列设计保守区域RT-PCR扩增引物，根据克隆得到的赤眼鳟β-肌动蛋白的cDNA核心片段设计两个5’-RACE下游引物，和两个3’-RACE上游引物。

进一步的，所述赤眼鳟肝脏的采集步骤包括解剖采集赤眼鳟肝脏，剪成100mg左右大小分装样品管中，液氮速冻，-70℃保存备用。

进一步的，所述从赤眼鳟肝脏中抽提总RNA的步骤包括将研钵置于烤箱中180℃烘烤3-4小时然后冷却至室温再用液氮预冷，剪取液氮中保存的肝脏约100mg，加液氮研磨成粉末，反复研磨三次后加入总RNA提取液并匀浆；将匀浆液转移至DEPC处理离心管，12000r/min 4℃离心10min，保留上清液，弃沉淀，上清室温放置5分后，加氯仿1mL，上下颠倒混匀15秒，室温放置5-10min，12000r/min 4℃离心15min；此时离心管内分为三层，将最上层上清液移至新离心管，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min，12000r/min 4℃离心10min；离心后弃上清，加入1mL DEPC水配制的75％的乙醇，悬浮沉淀，7500r/min4℃离心5min反复一次以彻底清洗；彻底去除乙醇，沉淀在室温下干燥30min左右，加20-30μL free-RNase的灭菌去离子水，55℃水浴溶解；再进行RNA浓度和纯度的检测。

进一步的，所述已知鱼类的β-肌动蛋白核苷酸序列设计保守区域PCR扩增引物为ACT01F:5’-TGGCATCACACCTTCTACAACGA-3’，ACT02R:5’-CCTTCATAGAGGCAAATAAGTTTCGG-3’，