[发明专利]一种产单宁酶假丝酵母菌的筛选及其酶活性测定方法

权利要求书

1.一种产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法，其特征在于，所述产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法包括以下步骤：

步骤一：土样处理，称量5.0g土样，置于装有45mL富集培养基的250mL三角瓶中，放入几颗小玻璃珠，在摇床中30℃、180r/min振荡富集培养24h；

步骤二：菌株的分离纯化，选出酶活性较稳定的菌株，转接至斜面培养基培养3d，保存于4℃冰箱备用；

步骤三：菌株摇瓶发酵并测其酶活性，纯化结束后将单菌落接种到富集培养液中培养18h，30℃、180r/min摇瓶培养72h并测定其酶活性，确定目的菌株；

步骤四：采用打孔法进行菌株复筛，制备粗酶液，利用打孔器，孔径为7mm，在鉴别培养基上打孔，将20μL粗酶液加入孔内，培养3d，看其降解圈的直径大小，进行产酶量的初步鉴定。

2.如权利要求1所述的产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法的筛选方法，其特征在于，所述步骤一中，土样取自于西双版纳茶园、张裕摩塞尔酒庄的葡萄园的土壤。

3.如权利要求1所述的产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤二中，菌株的分离纯化具体包括以下步骤：

(1)吸取1.0mL富集液，10倍梯度稀释至适当浓度后，涂布于平板鉴别培养基上，于培养箱中30℃恒温培养3d；

(2)挑取单一菌落于鉴别培养基上划线纯化，30℃恒温培养3d，连传5代培养；

(3)由变色圈的颜色深浅和直径大小可知单宁酶含量的高低，选出酶活性较稳定的菌株，转接至斜面培养基培养3d，保存于4℃冰箱备用。

4.如权利要求1所述的产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法，其特征在于，所述鉴别培养基中含有单宁酸和溴酚蓝指示剂，如果菌株产单宁酶就会水解培养基中的单宁酸产生没食子酸，使培养基中的溴酚蓝指示剂由蓝紫色变为黄色，在菌落周围形成明显的变色圈，保留产生变色圈的菌株。

5.如权利要求1所述的产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤三中，单菌落接种到富集培养液中培养18h，按10％的接种量接入到液体发酵培养基中。

6.如权利要求1所述的产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤四中，粗酶液的制备，选取酶活性相对较高且较稳定的单菌株GL-4进行发酵培养，发酵培养3d后，取2.0mL发酵液于离心管，4000r/min，离心10min，取上清液，即为粗酶液。

7.如权利要求1所述的产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤四中，打孔器直径为7mm。

8.一种由权利要求1～7任意一项所述产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法得到的单宁酶产生菌，其特征在于，所述单宁酶产生菌GL—4呈圆形，表面粘稠光滑，湿润，不透明，容易挑取，边缘和中央部位的颜色都很均一；培养初期，显微镜下的菌体均呈椭圆形，为单细胞个体；培养3d后，菌体较大，大细胞上带着较小的子细胞；GL-4菌体培养条件为：温度30℃，转速180r/min，GL-4所产单宁酶最适反应温度为40℃，最适pH为5，K⁺、Na⁺、Mg²⁺对酶活性有一定的激活作用，Mg²⁺对酶活性的影响最大。

9.一种包含权利要求8所述单宁酶产生菌的饮料。

10.一种如权利要求8所述产单宁酶假丝酵母菌的酶活性测定方法，其特征在于，所述产单宁酶产生菌的酶活性测定方法包括以下步骤：

(1)对产单宁酶菌株GL-4进行菌株的分子生物学鉴定；

(2)对产单宁酶菌株GL-4进行菌株的形态学鉴定：

1)取GL-4单菌落打散于无菌水中，稀释适当倍数后，无菌操作涂布于单宁酶鉴别培养基平板上，30℃恒温培养3d后，观察菌落形态特征；

2)在光学显微镜下分别观察菌株培养初期及培养3d后的细胞形态：在无菌操作条件下，挑取极少量新鲜菌体于洁净载玻片上，并蘸取少量无菌水进行稀释后镜检。