[发明专利]一种产单宁酶假丝酵母菌的筛选及其酶活性测定方法

说明书

本发明属菌株筛选鉴定技术领域，公开了一种产单宁酶假丝酵母菌的筛选及其酶活性测定方法，包括土样处理、菌株的分离纯化、摇瓶发酵并测其酶活性等，确定目的菌株；再通过打孔法和测量酶水解圈法进行菌种复筛。本发明通过摇瓶发酵、酶活性测定等一系列步骤，从土壤中分离纯化获得了1株酶活性较稳定的产单宁酶的菌株GL‑4；经分子生物学鉴定GL‑4菌属于假丝酵母菌，该菌株产酶酶活性为244.530U/mL。本发明的结果为产单宁酶微生物的分离筛选提供了实验依据，也为微生物源单宁酶生产奠定基础。通过正交试验，优化后其酶活性达到395.948U/mL，较优化前提高了61.9％。

技术领域

本发明属于菌株筛选鉴定技术领域，尤其涉及一种产单宁酶假丝酵母菌的筛选及其酶活性测定方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

1、单宁酸，是一种多酚类物质，除藻类、地衣及苔藓单宁酸含量低，茶叶、高粱、柿子、橡树、辽东栎、葡萄籽和葡萄皮等植物在未成熟期单宁酸的含量较高。单宁酸具有独特的涩味，能与蛋白质、果胶、生物碱等形成不溶性的复合物。

根据单宁酸化学结构和特性的差异，可将其划分为水解单宁酸和缩合单宁酸两大类。水解单宁酸分子中含有酯键，在单宁酶、稀碱或稀酸的作用下可水解成没食子酸或逆没食子酸和葡萄糖。而缩合单宁酸是黄烷醇衍生物，分子中的芳香环通过C-C键连接，因为不具有酯的结构，所以不易被单宁酶水解。

结构式：水解单宁酸、没食子酸及逆没食子酸的分子结构

2、单宁酶的应用

(1)茶饮料领域的应用

茶水中的多酚物质易与咖啡碱、蛋白质等形成络合物，造成溶液浑浊，出现“冷后浑”现象。在液态茶和速溶茶的生产过程中，需要采用物理、化学或酶处理法来使其变成可溶物。单宁酶被广泛应用于茶水中，它能切断茶多酚与没食子酸间的酯键，使苦涩味的酯型儿茶素水解生成游离的没食子酸，形成分子量较小的水溶性短链物质，从而降低茶水的混浊度。可口可乐公司利用单宁酶减少茶饮料中出现的“冷后浑”现象，取得了较好的效果，浑浊度由80％降至8％。

(2)果汁类饮品领域的应用

新兴石榴汁、木莓汁等，它们的抗氧化活性较好，但这些水果中单宁酸含量较高，使加工后的果汁口感苦涩，存在沉淀现象。由于常规的果汁脱苦技术无法有效地去除苦涩味，使酶促脱涩成为首选。

(3)饲料工业领域的应用

植物性饲料中含有单宁酸，一般情况下，植物中的单宁酸不利于动物的营养健康，因为家畜自身所产的消化酶蛋白和植物蛋白都会因单宁酸的存在而形成沉淀，影响其正常吸收。为了减少单宁酸的负面影响，提高家畜对植物蛋白的利用率和吸收率，降低畜牧业的生产成本，在饲料加工过程中通常用单宁酶进行相应处理。

综上所述，现有技术存在的问题是：

现有技术中单宁酶产量低，市场价格昂贵。单宁酰基水解酶(E.C.3.1.1.20)，通常被称为单宁酶，是偶然在一个从单宁酸水溶液中合成没食子酸的试验中发现的。单宁酶将单宁酸完全水解为没食子酸和葡萄糖，转化的中间产物是2,3,4,6- 四没食子酰葡萄糖和两种单没食子酰葡萄糖。单宁酶在植物、动物和微生物中都有存在，但它主要是利用微生物来生产的，例如细菌、酵母和真菌。由于分离筛选出产生该酶的菌量较少，其产量也偏低，稳定性较差，容易被污染，提取工艺较为复杂等问题，而且产单宁酶酵母菌的文献报道较少，仅有KenjiAoki 于1976年从假丝酵母菌的培养液中纯化过单宁酶，迄今鲜有报到。单宁酶的应用较为广泛，其研究与应用已经深入到食品加工、饲料加工及化妆品生产工艺过程中。然而，现存有的产单宁酶的菌株酶活性低，且单宁酶在整个反应系统中与底物、产物混在一起，难以回收利用，且对其酶学性质、最佳发酵表达和工业大规模生产等因素的了解不足，单宁酶目前在实际应用上有所欠缺。