[发明专利]一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针及其合成方法和应用

说明书

本发明提供一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针及其合成方法和应用。该荧光探针化学结构特征如下：荧光团母体是萘酰亚胺类染料，萘酰亚胺发色团母体连接取代基R，具体结构如式(1)所示。该小分子荧光探针在嘌呤基团的淬灭作用下荧光微弱，其能够专一性的识别SNAP标签蛋白并与其共价结合，结合后因嘌呤基团离去而荧光恢复。通过基因工程方法将SNAP标签蛋白与目标蛋白融合表达，利用该小分子荧光探针与SNAP标签蛋白的专一识别进而标记目标蛋白。由于标记前后荧光强度显著增强，标记后不需要清洗的步骤即可以直接应用，该探针可以在体外免洗标记，也可以免洗标记活细胞内的任一蛋白质，在生物及医学领域有极其重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针及其合成方法和应用。

背景技术

蛋白质的定点标记对于活细胞内蛋白质的定位与追踪具有重要的意义。通过小分子荧光探针标记蛋白来研究活细胞中蛋白质的位置、功能、以及蛋白-蛋白间通讯。目前常用的蛋白标及技术包括荧光蛋白融合法，单位点非天然氨基酸法，以及蛋白标签方法。荧光蛋白标记法存在蛋白尺寸较大、荧光相对稳定性差、且缺少近红外波段等缺点。非天然氨基酸的筛选过程复杂，耗时长，而且需要tRNA合成酶与改造的目标蛋白共表达，繁琐的改造与表达过程限制了非天然氨基酸技术的应用。相比之下，蛋白标签技术首先将标签蛋白与目标蛋白的融合表达，随后带有底物基团的荧光小分子通过与标签蛋白的专一性作用实现标记，该方法操作简单，可以选择任一荧光团作为母体，不但显示出荧光探针优越的光物理特性，而且对标记的位置与时间精准控制，被广泛的应用于目标蛋白的标记。目前常用的蛋白标签包括Halo，PYP，SNAP，BL等，其中SNAP标签是较常用的一个蛋白标签，他通过与O⁶-烷基鸟嘌呤衍生物的专一、共价连接而实现标记。各式的荧光小分子被设计出来用于快速、不可逆的蛋白标记，并且应用于药物监控、蛋白-蛋白相互作用、超分辨显微成像等。

尽管如此，目前大多数用于SNAP标签蛋白的小分子探针在标记过程中需要清洗掉未反应的小分子后再成像观察。这一清洗过程时间冗长，不利于目标蛋白的实时观察与追踪，通常情况下，多数非特异性结合的小分子清洗不彻底导致信噪比高，影响观测。因此，与SNAP蛋白反应前后有荧光变化的小分子探针的设计就显得尤为重要。目前已经有一些免洗的SNAP荧光探针被设计出来，包括DRBG-488，CBG-549-QSY7等，但其结构复杂，合成过程繁琐。最近报道的BGSBD探针尽管结构简单，但是该荧光团的荧光性能较差，应用受限。

发明内容

本发明的目的是提供一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针及其合成方法和应用该免洗标记特定蛋白质的荧光探针能够快速、专一、免洗的标记目标蛋白的小分子荧光探针，该探针可应用于体外检测或者活细胞内目标蛋白的生物成像。

本发明所述的一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针，该探针分子结构式如下：

其中：R为：(CH₂)_nCH₃,(n＝0-4),苄基、吡啶亚甲基等。

一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针的合成方法，合成路线如下：

具体合成步骤如下：

(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成

将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入脂肪伯胺。将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200:1-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺。

(2)SNAP蛋白的荧光探针的合成