[发明专利]一类高稳定性的免洗Halo-tag探针及其合成方法和生物应用

说明书

本发明提供了一类高稳定性的免洗Halo‑tag探针及其合成方法和生物应用，该探针为基于萘酰亚胺染料，设计合成的一类高稳定性的免洗Halo‑tag探针，其结构式如(1)所示，通过刚性的环胺对分子内扭转的抑制，该类Halo‑tag探针能够保持高的量子产率与稳定性，在水中量子产率达到0.80以上。此外，该类探针能够实现对活细胞内融合有Halo‑tag的目标蛋白特异性标记，实现免洗荧光成像。该类探针在单分子检测、超分辨荧光成像等领域有较好的应用前景。

技术领域

本发明属于荧光标记领域，具体涉及一类高稳定性的免洗Halo-tag探针及其合成方法和生物应用。

背景技术

对目标蛋白融合携带有功能的标签蛋白的方式已经成为目前对蛋白检测、分析的重要技术。荧光蛋白的引入，能够实现目标蛋白的荧光标记，从而可以通过荧光信号的采集在原位、实时监测蛋白的分布、数量、功能等。但是，荧光蛋白的改造较为复杂、颜色种类并不丰富，这为许多研究工作者带来了巨大困难。SNAP-tag、Halo-tag等标签蛋白与有机小分子荧光探针的协同发展很大程度上克服了这种问题。通过颜色丰富、结构简小的有机小分子荧光探针合理设计，可以实现荧光分子与标签蛋白的特异性、共价键连接，从而达到对目标蛋白的稳定标记。

Halo-tag是紫红红球菌中脱卤素酶的变异体，能够以共价键形式与卤素代烷烃结合。原生脱卤素酶中，卤代脂肪烃在天冬氨酸(Asn41)与色氨酸(Trp107) 的催化下(N-H-X形式的氢键)，受到天冬氨酸(Asp106)的羧基亲核进攻后生成烷基酯。烷基酯在天冬氨酸相邻的组氨酸(His272)催化下，进一步水解成醇。基于水解这一过程，将组氨酸(His272)突变为苯丙氨酸(Phe272)。当卤素脱去后生成的酯无法在苯丙氨酸存在下水解，即将反应停止在中间体酯，形成脱卤素酶与底物的稳定共价键。此外，由于Halo-tag并不是人源的酶经突变而来，故其在细胞内的特异性更高，与在细胞内非特异性标记几率很低。

基于有机小分子荧光染料的Halo-tag探针已经被广泛应用于蛋白标记中，但超分辨荧光成像技术及单分子检测技术的迅速发展对探针的稳定性、亮度提出了更高的要求。尤其在STED、STORM等超分辨技术中荧光染料的稳定性及信噪比直接影响成像的准确性与分辨率。目前，现有Halo-tag探针稳定性与亮度仍然不足，仍需要开发多波段的高稳定Halo-tag探针。

发明内容

本发明的目的之一是提供一类高稳定性的免洗Halo-tag探针，该类探针可实现活细胞内的免洗荧光成像。

本发明的另一目的是提供一类高稳定性的免洗Halo-tag探针的制备方法，该方法步骤简单、容易分离、原料价廉等优点。

本发明一类高稳定性的免洗Halo-tag探针，通过对萘酰亚胺分子内扭转的强力限制使分子达到荧光稳定性、亮度的大幅度提升，探针分子在水中量子产率最高可达0.80。

一类高稳定性的免洗Halo-tag探针，该类Halo-tag荧光探针具有如下结构 ：

其中，R₁与R₂分别为H、但若R₁为H，则R₂不为 H，R₃为C1-4烷基。

一类高稳定性的免洗Halo-tag探针的制备方法，此系列荧光探针合成路线，如下：

具体合成步骤如下：

(1)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr)的合成：