[发明专利]无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用、外泌体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用、外泌体及其制备方法和应用。本发明提供的外泌体制备方法，采用无创超声处理细胞，通过对细胞进行一定的刺激，调控细胞外泌体中的microRNA的表达丰度，和/或潜在的提高脑源神经营养因子的表达，和/或促进有害蛋白从脑内清除，和/或减轻有害物质对脑组织的氧化损伤。该方法对所有的细胞都适用，普适性好并且操作简单外泌体产量大，在短时间内即可得到目标外泌体。此外，该方法可以实现多种microRNA表达丰度的同时提升，可以得到更多microRNA表达改变的外泌体，而不是单个microRNA改变的外泌体。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用、外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

外泌体是一种存在于细胞外的多囊泡体，可通过细胞内吞泡膜向内凹陷形成多泡内涵体，内涵体与细胞膜融合后释放其中的小囊泡。外泌体的直径为30-150nm，包含RNA、蛋白质、microRNA、DNA片段等多种成分，在血液、唾液、尿液、脑脊液和母乳等多种体液中均有分布。microRNA是一类内源性具有调控功能的非编码RNA，可以与靶mRNA的3’非翻译区结合，从而导致靶基因不同程度的差异性表达，因此，外泌体可以通过将microRNA传递到靶细胞胞质中，再特异性结合到对应mRNA的3'端非编码区，从而调控靶基因表达。细胞在不同病理、生理条件下选择性生成含有不同内容物的外泌体。而且不同细胞分泌的外泌体具有不同的组分，对靶细胞调节作用亦不相同。

目前对外泌体的研究中，microRNA的研究最为广泛，通常采用对细胞进行基因转染，通过电转，将基因转染至细胞系，再进行耗时费力的筛选，构建表达目标microRNA的细胞系，然后再通过对细胞系进行培养，收集细胞培养上清中的外泌体，从而得到表达目标microRNA的外泌体。这样的方法弊端是可能需要几个月的实验时间才能完成细胞系的构建，而且通常只能对单个microRNA进行高表达。此外，由于不同细胞的差异化，每种构建方式的普适性很差。

因此，开发一种可以同时高效提高多个目标物质丰度，普适性好并且操作简单成本低的外泌体制备方法具有重要的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种外泌体的制备方法及外泌体，以缓解现有技术中外泌体的制备方法成本高、操作复杂并且难以实现多个目标物质表达调控的技术问题。

本发明的第二目的在于提供无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用。

本发明的第三目的在于提供外泌体在制备药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种外泌体的制备方法，包括以下步骤：采用无创超声处理细胞，提取得到外泌体。

进一步地，包括以下步骤：将无创超声处理过的神经细胞培养36-60小时后提取外泌体，得到外泌体。

进一步地，所述无创超声处理包括：在探头频率0.5-1.5MHz和幅值10-200mV条件下无创超声细胞1-30min，幅值优选为50-10mV，进一步优选为90-110mV；超声时间优选为1-20min，进一步优选为1-10min，更进一步优选为3-7min。

进一步地，所述神经细胞包括SH-SY5Y细胞、IMR-32细胞、TGW细胞、LAN-1细胞、HA细胞或N2A细胞，优选为SH-SY5Y细胞。

进一步地，所述提取外泌体的方法包括：将去除神经细胞和凋亡小体的培养基进行浓缩得到浓缩液，获得浓缩液与沉淀剂作用的沉淀物，分离沉淀物得到外泌体。

进一步地，所述沉淀剂包括聚乙二醇4000或聚乙二醇6000，优选为聚乙二醇6000，进一步优选为14％-18％(w/v)聚乙二醇6000；