[发明专利]一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法

权利要求书

1.一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：取保存好的金色分支杆菌接种在PDA平板上，30℃下培养3d，待金色分支杆菌长满平板后，将5mL无菌0.1mol/L的Tritonx-100注入平板，轻摇使金色分支杆菌孢子均匀分散取，于30℃恒温培养36h；

S2：将步骤S1中培养36h后的金色分支杆菌平板置于无菌紫外灯下照射处理，照射强度为285.8W/c㎡，照射时间为5-15min，然后将处理过的平板在光照下30℃培养36h，取出样本；

S3：将步骤S2中培养后的产生样本放入培养基A中，在30℃的温度下，培养45h，所述的培养基A通过牛肉浸膏0.4g、氨基酸1.2g和无机盐0.5g混合搅拌5min，再加入琼脂2g搅拌2min，静置10min所制备；

S4：将步骤S3中所得到菌株作为出发菌株，采用常压温室等离子(ARTP)诱变技术对出发菌株的单细胞悬浮液进行诱变处理，然后依据H+依赖型脱氧酶缺失型方法进行初步筛选，通过摇瓶进行复筛得到变异金色分支杆菌；

S5：将步骤S4中所得到变异金色分支杆菌进行去核处理，将全基因合成的DNA生物酶基因片段孕烯醇酮提取到去核的变异金色分支杆菌中，构建产孕烯醇酮的金色分支杆菌；

S6：将步骤S5中所得到的金色分支杆菌置于培养基B中，在光照环境下30℃培养36h，对金色分支杆菌进行加工，洗出孕烯醇酮与粗产物,所述的培养基B通过牛肉膏3g，蛋白胨10g，无机盐5g，葡萄糖15g，琼脂16g，加水1L,混合搅拌均匀，静置10min所制备。

2.根据权利要求1所述的一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：所述步骤S5中的全基因合成的DNA生物酶基因片段孕烯醇酮提取包括以下步骤：

B1：首先将含有孕烯醇酮的组织块进行材料处理；

B2：对经过B1处理过的孕烯醇酮组织块进行培养细胞处理；

B3：对经过B2处理的细胞液进行DNA提取。

3.根据权利要求2所述的一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：所述B1步骤中对将含有孕烯醇酮的组织块进行材料处理时，先取含有孕烯醇酮的组织块0.3-0.5cm³，将其剪碎，加TE缓冲溶液0.5ml再转移到匀浆器中匀浆，取匀浆液转移到1.5mL离心管中，加入20％SDS 25mL,蛋白酶，再对其进行60℃水浴1h。

4.根据权利要求3所述的一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：所述B2步骤中对经过B1处理过的孕烯醇酮组织块进行培养细胞处理时，先对经过B1步骤处理后的细胞液常温静止悬浮后，用TBS缓冲液洗一次，再离心4000g×5min，去除上清液，然后加10倍体积的裂解缓冲液，最后在50℃水浴1h。

5.根据权利要求4所述的一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：所述B3步骤中对经过B2处理的细胞液进行DNA提取时，先对经过B2处理后的细胞液中加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5mL离心管中，加等体积饱和酚溶液，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管，加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中，如水相仍不澄清，可重复此步骤数次，加等体积氯仿溶液，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中，加1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀，待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液，再进行沉淀用，75％乙醇溶液洗涤，离心5000g×3min，弃上清液，在室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100ml TE缓冲液溶解。