[发明专利]一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法

说明书

本发明涉及孕烯醇酮制备技术领域，公开了一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，步骤为，S1：取保存好的金色分支杆菌接种在PDA平板上，30℃下培养3d，待金色分支杆菌长满平板后，将无菌Tritonx‑1000.1％5mL注入平板，轻摇使金色分支杆菌孢子均匀分散取，将悬浮液接种于沙仕固体培养基中，于30℃恒温培养36h；S2：将步骤S1中培养36h后的金色分支杆菌平板置于无菌紫外灯下照射处理，照射强度为285.8W/c㎡，照射时间为5‑15min，然后将处理过的平板在光照下30℃培养36h，取出样本；S3：将步骤S2中培养后的产生样本放入培养基中，在30℃的温度下，培养45h。该采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，能够解决目前生产方法效率低，成本较高，不能满足生产需求的问题。

技术领域

本发明涉及孕烯醇酮制备技术领域，具体为一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法。

背景技术

在肾上腺和性腺中合成的各种类固醇能够调节CNS中的神经元兴奋性。对于这些化合物，已产生术语“刺激神经组织的类固醇”(Majewska等,1986)，或脑可以重新合成的“神经类固醇”(Baulieu,1991)。很久之前就已公认类固醇激素在动物和人类中具有镇静、麻醉和抗咬合的性质(Aird,1944；Aird和Gordan,1951；Gyermek等,1967；Green等,1978)。过去二十年间的研究揭示黄体酮和去氧皮质酮分别充当内源性神经类固醇别孕烯醇酮(5α-孕烷-3α-ol-20-酮)和THDOC(5α-孕烷-3α,21-二醇-20-酮)的前体(Reddy,2003；2009a)。睾丸激素衍生的雄激素例如二氢雄甾酮(5α-雄甾烷-3α,17β-二醇)和雌二醇可以被认为是神经类固醇(Reddy,2008)。通常，神经类固醇的急性效应与和传统的调节基因转录的类固醇激素受体的相互作用无关。此外，神经类固醇本身在胞内类固醇受体中无活性。它们主要通过与神经元的膜受体(主要是GABA-A受体)和离子通道的相互作用调节脑兴奋性(Lambert等,2003；Reddy,2003；Akk等,2009)。现有技术中，孕烯醇酮是一种重要的药物合成中间体，由它能合成大部分甾体激素类药物，在国内它的年产量在1000吨左右，市场需求量较大，现有的生产方法效率低，成本较高，不能满足生产需求。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，具备生产方法效率高，成本较低等优点，解决了目前生产方法效率低，成本较高，不能满足生产需求的问题。

为实现生产方法效率高，成本较低的目的，本发明提供如下技术方案：一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，

一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，包括以下步骤：

S1：取保存好的金色分支杆菌接种在PDA平板上，30℃下培养3d，待金色分支杆菌长满平板后，将5mL无菌0.1mol/L的Tritonx-100注入平板，轻摇使金色分支杆菌孢子均匀分散取，于30℃恒温培养36h；

S2：将步骤S1中培养36h后的金色分支杆菌平板置于无菌紫外灯下照射处理，照射强度为285.8W/c㎡，照射时间为5-15min，然后将处理过的平板在光照下30℃培养36h，取出样本；

S3：将步骤S2中培养后的产生样本放入培养基A中，在30℃的温度下，培养45h，所述的培养基A通过牛肉浸膏0.4g、氨基酸1.2g和无机盐0.5g混合搅拌5min，再加入琼脂2g搅拌2min，静置10min所制备；

S4：将步骤S3中所得到菌株作为出发菌株，采用常压温室等离子(ARTP)诱变技术对出发菌株的单细胞悬浮液进行诱变处理，然后依据H+依赖型脱氧酶缺失型方法进行初步筛选，通过摇瓶进行复筛得到变异金色分支杆菌；

S5：将步骤S4中所得到变异金色分支杆菌进行去核处理，将全基因合成的DNA生物酶基因片段孕烯醇酮提取到去核的变异金色分支杆菌中，构建产孕烯醇酮的金色分支杆菌；