[发明专利]一种基因编辑方法在东方拟无枝酸菌中的应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas9编辑系统在东方拟无枝酸菌中进行基因敲除与敲入的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、构建含有Cas9和sgRNA的骨架质粒pKCpGcas9EgdgtfD-NA；

步骤二、构建含有eGFP的靶标序列同源臂；

步骤三、含有gtfD基因同源臂的编辑质粒pLYNY04的构建

将步骤一的骨架质粒pKCpGcas9EgdgtfD-NA使用限制性内切酶进行线性化；接着，使用同源重组试剂盒将步骤二的带有eGFP的靶标序列同源臂整合到线性化的pKCpGcas9EgdgtfD-NA中，获得含有gtfD基因同源臂的编辑质粒pLYNY04；

步骤四、将编辑质粒pLYNY04电转化入A.orientalis HCCB10007

将步骤三得到的含有gtfD基因同源臂的编辑质粒pLYNY04电转入感受态A.orientalisHCCB10007细胞，同时实现eGFP的敲入以及定点靶标序列的敲除。

2.如权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9编辑系统在东方拟无枝酸菌中进行基因敲除与敲入的方法，其特征在于，所述含有Cas9和sgRNA的骨架质粒pKCpGcas9EgdgtfD-NA的构建方法为：

利用NdeI/HindIII双酶切pKCcas9dO，获得cas9sco载体；

接着，以pKCcas9dO为模板，用如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物序列进行PCR扩增，获得sgRNA重组片段；

接着，以A.orientalis HCCB10007基因组为模板，使用如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物序列进行PCR扩增，获得内源GADPH启动子；接着，以pIB139为模板，用如SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所示的引物序列进行PCR扩增，获得PermE*启动子片段；

接着，将cas9sco载体、sgRNA重组片段、内源GADPH启动子、PermE*启动子片段连接，获得CRISPR/Cas9骨架质粒pKCpGcas9EgdgtfD-NA。

3.如权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9编辑系统在东方拟无枝酸菌中进行基因敲除与敲入的方法，其特征在于，含有eGFP的靶标序列同源臂的构建方法为：

以A.orientalis HCCB10007基因组作为模版分别用如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物序列以及用如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物序列扩增上下游同源臂片段；

接着，将扩增出的上下游产物经DNA回收试剂盒回收后，采用如SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12所示的引物序列进行Overlap重组，获得的gtfD同源臂片段经DNA回收试剂盒回收后进行T/A克隆并测序，测序正确的质粒经KpnI/PstI酶切后回收；

接着，使用KpnI/PstI酶切质粒pLYGYQ2，回收大小为1054bp的eGFP序列，两个片段通过酶切连接获得带有eGFP的gtfD同源臂。

4.一种含有gtfD基因同源臂的CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04，其特征在于，所述CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04是将权利要求1或2所述的骨架质粒pKCpGcas9EgdgtfD-NA线性化，并使用同源重组试剂盒将权利要求1或3所述的带有eGFP的gtfD同源臂整合到线性化的pKCpGcas9EgdgtfD-NA中构建获得。

5.一种如权利要求4所述的含有gtfD基因同源臂的CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04在制备万古霉素高产菌的应用。

6.一种如权利要求4所述的含有gtfD基因同源臂的CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04在制备定点整合东方拟无枝酸菌突变株中的应用。

7.一种能有效编辑东方拟无枝酸菌的万古霉素合成簇糖基转移酶gtfD基因的sgRNA的引物对序列，其特征在于，所述引物对序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。