[发明专利]一种基因编辑方法在东方拟无枝酸菌中的应用

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9编辑系统在东方拟无枝酸菌中进行基因敲除与敲入的方法，该方法将CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04引入东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalis HCCB10007中，同时实现了基因敲除与敲入，可以简化遗传操作，提高东方拟无枝酸菌的整合效率。本发明还公开了一种含有gtfD基因同源臂的CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04，将eGFP插入东方拟无枝酸菌的靶标序列，以便于检测基因编辑结果。本发明还公开了一种含有gtfD基因同源臂的CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04的应用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，是关于一种基因编辑方法在东方拟无枝酸菌中的应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统，这是目前开发的一种快速、简单的对基因组进行定点编辑的新技术，只需要将一个单一的Cas9蛋白与sgRNA相结合，就能识别并切割特定DNA序列完成高效的基因编辑。利用这一特点，Cas9系统可成功与体外重组系统进行联用，直接从染色体上精确克隆片段DNA。自2013年CRISPR/Cas技术应用于基因敲除以后，这种构建快速、结构简单，高效的分子工具很快便被大家所接受，如今已成功应用于包括水稻、小麦、疟原虫、果蝇、斑马鱼以及哺乳动物等真核生物中。不仅在真核生物中，此系统在原核生物，如大肠杆菌以及微生物药物重要来源的链霉菌等体内基因功能研究方面也显示出优于传统的同源重组等其它现有技术之处。Cas9系统也被证明可以成功与体内重组系统联用进行大片段DNA的精确克隆。

万古霉素是众多耐药菌(如甲氧西林耐药的金黄葡萄球菌)引起感染的首选药物。东方拟无枝酸菌A.orientalis为万古霉素产生菌，对该菌应用基因工程技术进行基因编辑，对于提高万古霉素的产量、了解万古霉素的生物合成机制以及挖掘万古霉素衍生物具有重要意义。然而，目前传统的同源重组方法进行遗传操作，效率相对较低。于是本发明尝试将CRISPR/Cas9基因编辑系统引入东方拟无枝酸菌A.orientalis中以提高其整合效率，简化遗传操作。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种基于CRISPR/Cas9编辑系统在东方拟无枝酸菌中进行基因敲除与敲入的方法，该方法将CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04引入东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalis HCCB10007中，同时实现了基因敲除与敲入，可以简化遗传操作，提高东方拟无枝酸菌的整合效率。本发明的第二个目的是提供一种含有gtfD基因同源臂的CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04，将eGFP插入东方拟无枝酸菌的靶标序列，以便于检测基因编辑结果。本发明的第三个目的是提供一种含有gtfD基因同源臂的CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04在制备万古霉素高产菌的应用。本发明的第四个目的是提供一种含有gtfD基因同源臂的CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04在制备定点整合东方拟无枝酸菌突变株中的应用。本发明的第五个目的是提供一种能有效编辑东方拟无枝酸菌的万古霉素合成簇糖基转移酶gtfD基因的sgRNA的引物对序列，所述引物对序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

基于以上目的，本发明的第一个方面，提供一种基于CRISPR/Cas9编辑系统在东方拟无枝酸菌中进行基因敲除与敲入的方法，包括如下步骤：

步骤一、构建含有Cas9和sgRNA的骨架质粒pKCpGcas9EgdgtfD-NA；

步骤二、构建含有eGFP的靶标序列同源臂；

步骤三、含有gtfD基因同源臂的编辑质粒pLYNY04的构建；

将步骤一的骨架质粒pKCpGcas9EgdgtfD-NA使用限制性内切酶进行线性化；接着，使用同源重组试剂盒将步骤二的带有eGFP的靶标序列同源臂整合到线性化的pKCpGcas9EgdgtfD-NA中，获得含有gtfD基因同源臂的编辑质粒pLYNY04；