[发明专利]一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针及其制备方法及应用

权利要求书

1.一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针，其特征在于该探针的结构如下：

2.根据权利要求1所述的一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的合成方法，其特征在于按照如下步骤进行：

(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：

将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和4-氨甲基苄醇溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液冷却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；

(2)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：

将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入环己二胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺；

(3)SNAP-tag探针的合成

将N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾和2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应3-10h后，加压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得免洗SNAP-tag探针。

3.根据权利要求2所述的一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(1)中：4-溴-5-硝基-1,8-萘酐：4-氨甲基苄醇的质量比为1:0.5-2；

4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:20-80g/mL。

4.根据权利要求2所述的一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(2)中：N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与环己二胺的质量比为1:1-3；

N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:50-200g/mL。

5.根据权利要求2所述的一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(3)中：N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤的质量比为1:1-5:1-5；

N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:50-200g/mL。

6.一种如权利要求1所述的高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针在细胞、组织及活体内的荧光成像领域的应用。

7.一种如权利要求1所述的高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针用于SNAP-tag蛋白的识别与检测。

8.一种如权利要求1所述的高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针在单分子检测中的应用。

9.一种如权利要求1所述的高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针在STED及SIM超分辨成像中的应用。