[发明专利]一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针及其制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种高亮度、高稳定性免洗SNAP‑tag探针及其制备方法和应用，该探针为在萘酰亚胺4，5‑位引入环己二胺刚性环设计合成的一种高亮度、高稳定性免洗SNAP‑tag探针，其结构式如(1)所示。由于聚集诱导荧光淬灭的效应，探针分子在水中荧光亮度极低，而与SNAP‑tag结合后荧光量子产率可达0.80以上，荧光增强约28倍。因此，该探针能够对活细胞内融合有SNAP‑tag的目标蛋白进行特异性标记并实现免洗荧光成像。此外，由于稳定性及亮度的提升，该探针实现了超分辨荧光成像(SIM/STED)，分辨率达到120nm。

技术领域

本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag 探针及其制备方法和应用。

背景技术

SNAP-tag标签法已经成为目前应用最为广泛的蛋白质标记技术，通过其与目标蛋白的融合可以对目标蛋白进行示踪、功能的监测等。因此借助有机小分子染料的合理设计可以实现对目标蛋白的多色荧光标记，在单分子检测及超分辨荧光成像领域对蛋白进行实时监测。这也就要求基于小分子的SNAP-tag荧光探针拥有高稳定性的同时在结合SNAP-tag之后有高的荧光增强倍数，以实现精准成像、高信噪比。

而目前的商业SNAP-tag探针通常连接有罗丹明、花菁染料，与SNAP-tag 结合后荧光增强倍数只有1-2倍。此外，罗丹明与花菁染料的正电性导致此类探针极容易在线粒体聚集，很大程度上增加了荧光成像的背景。因此，科研工作者将环境敏感型荧光染料与苄基鸟嘌呤结合设计合成了诸多荧光增强型 SNAP-tag探针。这类探针通过在水环境荧光量子产率低，非极性环境中荧光量子产率高的特点达到荧光增强的目的。然而，通常从水环境到SNAP-tag疏水空腔中荧光伴有大幅的蓝移。在细胞复杂的环境中很难采用合适的波段捕捉荧光信号，从而导致荧光信号的误差。如何通过环境不敏感型荧光染料的合理设计达到与SNAP-tag结合后高荧光增强倍数的同时实现信号采集的准确性是目前 SNAP-tag探针设计及应用的屏障。

发明内容

本发明提供了一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针，该探针与 SNAP-tag蛋白结合后荧光强度增加28倍，可实现活细胞内的免洗荧光成像。

本发明提供一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的制备方法，该方法步骤简单、易于提纯等优点。

本发明提供一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针，通过萘酰亚胺4,5- 位环己二胺的引入达到荧光稳定性、亮度得到大幅度提升，实现了SNAP-tag蛋白的免洗超分辨荧光成像。此外，萘酰亚胺变为环境不敏感型荧光染料，在与 SNAP-tag结合前后荧光峰型及波长不随微环境变化而发生变化，保持了荧光信号的准确性。

一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针，该荧光探针具有如下结构：

一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的合成方法，此荧光探针合成路线如下：

具体合成步骤如下：

(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)的合成：

将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和4-氨甲基苄醇溶于无水乙醇中。将反应液加热至 40-90℃，搅拌1-10h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体 N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)；

(2)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：