[发明专利]一种含MAR核心片段的动物细胞表达载体

说明书

本发明公开了一种含MAR核心片段的动物细胞表达载体。所述重组表达载体的MAR核心片段，其核苷酸碱基序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。本发明的表达载体可有效提高蛋白在哺乳动物细胞中的产量并降低生产成本。

本申请是2014年4月1日提交的201410129979.2号发明专利申请“一种新型的含MAR核心片段的动物细胞表达载体”的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，公开了一种含MAR核心片段的动物细胞表达载体。

背景技术

目前，很多用于生产重组蛋白的载体已被开发，重组蛋白在以细菌、真核微生物、昆虫细胞等为宿主的表达中能获得较高的产量，但这些表达系统缺少类似于哺乳动物细胞的蛋白质修饰机制(例如糖基化修饰等)，表达的动物蛋白易缺少生物活性或因折叠错误而产生包涵体。而以哺乳动物细胞表达系统来生产重组蛋白，其产量往往较低，而且导入基因的稳定性也会有一定的问题。后来人们发现，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是生产单克隆抗体等复杂大分子的最佳系统，利用CHO表达系统生产单克隆抗体，其产率有了很大的提高，但是筛选和维持高表达细胞株仍是件耗时耗力且结果不确定的工作。细胞转染后，融合基因通常随机整合入宿主细胞的基因组中，大多数的重组发生于“静默区”，例如非转录区。通常需要筛选上千个克隆才能得到几个产量尚可的细胞株。

核基质附着区(matrix attachment region，简称MAR)元件是一种能帮助产生并维持开放的染色质域的DNA序列。开放的染色质域能促进转录，表达及转基因的多拷贝整合。将MAR元件放入载体中能增加细胞株的产量及高产细胞株的比例(Kwaks TH,Otte AP2006Trends Biotechnol 24:137–142)，但MAR元件较大(3kb以上)，而质粒转染细胞的效率随着质粒大小的增加而降低(Yin W et al Anal Biochem.2005Nov15；346(2):289-94)，从而限制了MAR元件在双亚基共表达载体中的应用。

因此，开发一种更为有效的哺乳动物细胞表达载体，一直是本领域的技术人员急待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以提高导入基因在哺乳动物细胞中表达的表达载体，所述表达载体两端含有人工转录因子结合位点的核基质附着区的MAR核心片段。该表达载体可有效提高蛋白在哺乳动物细胞中的产量并降低生产成本。

具体地，发明公开了：

1、一种分离的重组表达载体的MAR核心片段，其核苷酸碱基序列如SEQ ID NO：

1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。

2、一种重组表达载体，所述载体两端含有上述1所述的MAR核心片段。

3、上述2所述载体，其所述MAR核心片段插入在启动子的上游及聚腺苷酸化位点的下游。

4、上述3所述载体，所述启动子为CMV、SV40或EF-1a启动子。优选地，所述MAR核心片段插在载体上游FSP I位点,或SV40PA下游Afe I位点,或PEF-1a上游Nhe I位点,或BGHPA下游EcoRV位点。最优选上游FSP I位点及PEF-1a上游Nhe I位点。

5、上述2-4任一所述载体，所述载体为pBudCE4.1、pDR1、pcDNA3.1(+)、pDHFF或pCHO 1.0，或者上述载体的改造载体。

6、上述5所述载体，所述载体为pBudCE4.1改造的载体，所述载体核苷酸序列如SEQID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示。

7、上述2-6任一所述载体，其中所述载体包含一个或多个编码一种或多种重组蛋白的功能重组基因。