[发明专利]一种血清淀粉样蛋白A抗原表位、其预测与验证方法及单克隆抗体的制备方法

说明书

本发明涉及一种血清淀粉样蛋白A抗原表位的预测与验证方法及单克隆抗体的制备方法，预测与验证方法为预测血清淀粉样蛋白A抗原的表面可及性、弹性序列区域、β转角、抗原性、亲水性、线性表位、长片段表位，分别获得多个表位序列；去除多个表位序列中的重复的表位和包含在其他较长表位中的序列，得到多个非冗余预测表位；采用ELISA验证多个非冗余预测表位是否为抗体的识别表位。本发明克服了单一方法预测准确率低的问题；并通过实验验证，解决了SAA抗原表位未知的问题；应用合成的抗原表位多肽制备单克隆抗体，克服了SAA难以纯化获取的困难的问题，使成本降低一倍以上。

技术领域

本发明属于生物技术制备体外诊断原料领域，属于体外诊断行业临床诊断试剂盒制备的原料，具体涉及一种血清淀粉样蛋白A抗原表位、其预测与验证方法及单克隆抗体的制备方法。

背景技术

体液免疫或抗体产生主要由B细胞介导，B细胞识别抗原通过膜结合抗体或B细胞受体 (B cell receptor，BCR)来识别抗原，所结合的抗原部位即为B细胞表位，最终诱导抗体基因的编辑和抗体的分泌，分泌的抗体结合抗原从而失活或消除抗原。

免疫信息学是利用计算机方法在免疫学上应用并解决免疫问题的信息学方法，是生物信息学的一个分支。免疫信息学的两个中心目标就是B细胞表位和T细胞表位的预测，为实际可行的成果转化提供了非常重要的预测参考结果。源于近年来高通量测序技术的迅猛发展，生物信息研究人员开发了多种免疫信息学工具，但是，这种工具都是独立的针对高通量数据的某一特定特性或特征进行的大数据分析，目前缺少对特定抗原的表位分析，更重要的是缺少对所分析的表位进行筛选验证和抗体制备等实际应用。目前血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A,SAA)的抗原表位(或B细胞表位)未经免疫信息学预测和实验筛选验证。

体内稳态对于包括人在内的所有生物系统都是必须的，而急性时相反应(acute-phase response，APR)是一种原始的体内稳态被破坏条件下重建稳态的机制之一。在急性时相反应中血清变化最显著的是血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A,SAA)和C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)。

SAA由104个氨基酸组成，在机体受感染后，SAA在4-6h内即可迅速升高约1000倍，清除病原体后又可迅速的降低至正常水平，是新兴的反映机体感染情况和炎症恢复的灵敏指标。SAA与目前临床最广泛使用的CRP相比较，有其明显的优势：(1)SAA升高见于病毒、支原体、细菌感染，且敏感性高于CRP；(2)在细菌感染性疾病中，SAA比CRP上升早、幅度大、灵敏度高，尤其是在急性细菌感染早期，SAA检测结果更加显著；(3)SAA在病毒感染性疾病中，SAA显著升高，CRP不升高，因此SAA可以作为诊断病毒感染的敏感指标。此外，SAA水平还与多种肿瘤、肥胖及其代谢合并症、继发性淀粉样变、冠心病、移植排斥反应，动脉粥样硬化等诸多疾病密切相关，能为临床诊断提供众多有价值的参考信息。

SAA水溶性差一直是阻碍其功能研究和抗原纯化的重要阻碍，也正是因此，人SAA和重组SAA(rSAA)的获取是SAA诊断抗体研发制备过程中的重要困难。

SAA是一种亲油性蛋白，且超过95％和高密度脂蛋白及胆固醇等脂类结合在一起，也和多种细胞受体、粘多糖、胱抑素C等拥有相互作用和结合，游离的SAA很少且极易被细胞吞噬降解为组织淀粉样蛋白A(AA)。SAA与HDL等的结合也使得只有部分的抗原表位序列处于临床诊断中的表面可及性状态下，而截至目前未见已确定的SAA抗原表位(或B细胞表位)报道。

综上所述，现有技术主要存在如下问题：

1、目前的免疫信息学方法和工具主要针对高通量数据的B细胞抗原表位一般性预测，预测准确率低，且缺少对抗原表位的实验筛选验证，亦缺少对应用已验证抗原表位制备抗体的应用。

2、截至目前未见SAA抗原表位的研究报道，SAA抗原表位的免疫信息学分析及后续实验筛选验证也处于空白状态。