[发明专利]一种生物酶法合成D-苹果酸的方法

权利要求书

1.一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.利用大肠杆菌Rosetta(DE3)作为宿主菌，共表达来源于产碱假单胞菌的马来酸水合酶的大小亚基PaHbzI和PaHbzJ，获得共表达马来酸水合酶大小亚基PaHbzI和PaHbzJ的大肠杆菌工程菌pETDuet-PahbzI-PahbzJ/Rosetta(DE3)，即DHIJ工程菌；具体的，所述DHIJ工程菌的构建包括以下步骤：

（1）根据大肠杆菌密码子偏好性优化所述马来酸水合酶的大小亚基PaHbzI和PaHbzJ的基因序列；所述PaHbzI的基因序列如Sequence ID NO：1所示，所述PaHbzJ的基因序列如Sequence ID NO：2所示；

（2）在PahbzI基因序列两端添加NcoI和BamHI，在PahbzJ基因序列两端添加NdeI和XhoI后，利用全基因合成技术合成优化后的马来酸水合酶大小亚基PahbzI和PahzJ，构建克隆载体pUC57-PahbzI和pUC57-PahbzJ；

（3）构建重组表达载体：用NcoI和BamHI分别双酶切pETDuet-1质粒和步骤（2）得到的pUC57-PahbzI质粒，胶回收获得载体骨架pETDuet-1和PahbzI片段，接着用T4 DNA ligase连接载体骨架pETDuet-1和PahbzI片段，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃恒温倒置过夜培养，筛选获得阳性重组子，抽提质粒获得pETDuet-PahbzI质粒；用NdeI和XhoI分别双酶切pETDuet-PahbzI质粒和步骤（2）得到的pUC57-PahbzJ质粒，胶回收获得载体骨架pETDuet-PahbzI和PahbzJ片段，用T4 DNA ligase连接载体骨架pETDuet-PahbzI和PahbzJ片段，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃恒温倒置过夜培养，筛选获得阳性重组子，抽提质粒获得pETDuet-PahbzI-PahbzJ质粒；

（4）将上述步骤（3）中所得的pETDuet-PahbzI-PahbzJ质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，涂布氨苄抗性平板，37℃恒温倒置过夜培养，筛选获得阳性重组子，即得DHIJ工程菌，保存甘油管；

B.通过生物发酵DHIJ工程菌获得大量表达马来酸水合酶大小亚基的湿菌体，再利用湿菌体全细胞生物酶法转化马来酸合成D-苹果酸；具体的，所述DHIJ工程菌的生物发酵包括以下步骤：

（1）无菌条件下，用接种环从DHIJ工程菌甘油管中取一环菌移种至一级种子培养基中，37℃，240rpm培养至OD₆₀₀至3.0～4.0，得一级种子菌液；

（2）将一级种子菌液按4%～10%接种量转接二级种子培养基中，37℃，240rpm培养3～5h，得二级种子菌液；

（3）按1%～10%的接种量将培养好的二级种子菌液通过火焰接种转接入发酵罐中，初始发酵参数：温度37℃，转速200rpm，pH7.0，通气量50L/h,罐压0.05MPa；随着发酵时间的延长，菌浓度逐渐增加需通过调节转速和通气量将溶氧控制在20%～40%；当溶氧和pH值同时快速升高时，开始流加补料；OD₆₀₀达到20～25时，先将温度降至30℃，再添加0.2mM诱导剂，继续发酵8h～12h后放罐，通过低温离心收集菌体并冷藏；

所述全细胞生物酶法转化马来酸合成D-苹果酸的具体的步骤如下：用4mol/LNaOH溶液将转化体系pH调至7.5，32℃，200rpm转化16h，即获得D-苹果酸，所述转化体系包括1.5mol/L马来酸，75g/L碳酸钙，3g/LTris碱，0.25g/LCTAB，4%湿菌体。

2.根据权利要求1所述的一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，其特征在于，DHIJ工程菌的生物发酵过程中，所述步骤（1）中的一级种子培养基为LB培养基。

3.根据权利要求1所述的一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，其特征在于，DHIJ工程菌的生物发酵过程中，所述步骤（2）中的二级种子培养基为TB培养基。