[发明专利]一种生物酶法合成D-苹果酸的方法

说明书

本发明公开了一种生物酶法合成D‑苹果酸的方法，属于有机酸制备领域，具体涉及一种用大肠杆菌工程菌全细胞酶法制备D‑苹果酸的方法。本发明利用基因工程手段在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌中共表达了马来酸水合酶的大小亚基，通过生物发酵获得过表达马来酸水合酶的菌体，全细胞生物酶法转化马来酸合成D‑苹果酸，产量为200.17g/L，转化率高达99.97％。本发明构建基因工程菌培养条件简单，发酵周期短，发酵成本低，易于实现菌体高密度发酵，菌体收率高，底物转化率高，有利于生物酶法合成D‑苹果酸的产业化大规模生产。

技术领域

本发明属于有机酸制备领域，具体涉及一种用大肠杆菌工程菌全细胞酶法制备D-苹果酸的方法。

背景技术

D-苹果酸，又称羟基丁二酸或羟基琥珀酸，是自然界中存在稀少的一种有机酸，主要应用于手性药物合成、手型添加剂和手型助剂等领域，例如抗生素、抗病毒药物、抗癌药物、 D-或L-肉毒碱和维生素(R)-泛酸等合成中的应用，也可作为配体合成药物拆分剂。

目前合成D-苹果酸的方法主要有化学拆分法、生物酶拆分法和生物酶法。其中，化学拆分法合成D-苹果酸的成本高，不利于工业化生产；生物酶拆分法合成D-苹果酸的生产浓度很低，远远达不到工业化要求；生物酶法转化合成D-苹果酸的研究报道最经济的路线是从马来酸转化合成D-苹果酸，1993年日本研究人员Asano Y.等报道了用Arthrobactersp.MCI2612 菌以马来酸为原料进行生物转化合成D-苹果酸，产量为87g/L，摩尔转化率为72％；1993年荷兰研究人员Marieet J.van der Werf等利用Pseudomonaspseudoalcaligenes NCIMB9867催化马来酸钠制备D-苹果酸，产物浓度为107g/L，转化率99.4％。2004年何冰芳等(CN 1325634C) 报道了一种简单脂肪杆菌(Pimelobactersimplex)DM18，以马来酸盐为底物生物转化合成 D-苹果酸盐，产量高达487g/L，转化率达99％。然而应用这些从自然环境中筛选的微生物进行生物酶法合成D-苹果酸时，菌种发酵生物量非常低，最高OD₆₆₀有4.5，严重制约着D-苹果酸的工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，解决上述背景技术中提出的现有的生物酶法转化制备D-苹果酸的过程中马来酸水合酶活性低，稳定性差，菌种发酵生物量低以及难以实现工业化生产的问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种生物酶法合成D-苹果酸的方法，包括以下步骤：

A.利用大肠杆菌Rosetta(DE3)作为宿主菌，共表达来源于产碱假单胞菌的马来酸水合酶的大小亚基PaHbzI和PaHbzJ，获得共表达马来酸水合酶大小亚基PaHbzI和PaHbzJ的大肠杆菌工程菌pETDuet-PahbzI-PahbzJ/Rosetta(DE3)，即DHIJ工程菌；

B.通过生物发酵DHIJ工程菌获得大量表达马来酸水合酶大小亚基的湿菌体，再利用湿菌体全细胞转化马来酸合成D-苹果酸。

进一步地，所述DHIJ工程菌的构建包括以下步骤：

(1)根据大肠杆菌密码子偏好性优化所述马来酸水合酶的大小亚基PaHbzI和PaHbzJ的基因序列；

(2)在PahbzI基因序列两端添加NcoI和BamHI，在PahbzJ基因序列两端添加NdeI和XhoI后，利用全基因合成技术合成优化后的马来酸水合酶大小亚基PahbzI和PahzJ，构建克隆载体pUC57-PahbzI和pUC57-PahbzJ；