[发明专利]人肺炎链球菌表面蛋白单克隆抗体及应用

权利要求书

1.一种产生人肺炎链球菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述产生人肺炎链球菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号是保藏编号CCTCC NO：C2017209的杂交瘤细胞株Sp-18#。

2.一种产生人肺炎链球菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

1)重组人肺炎链球菌PspA蛋白的制备：

对人肺炎链球菌表面蛋白PspA基因进行生物信息学分析，所述人肺炎链球菌表面蛋白PspA的NCBI蛋白质数据库中的accession number为AAF27703.1，结合GC含量、密码子偏爱性、mRNA二级结构、RNA不稳定基序以及mRNA自由能稳定性，优化人肺炎链球菌表面蛋白PspA的DNA编码序列，同时在人肺炎链球菌表面蛋白PspA的DNA编码序列的5’引入酶切位点NdeI、在人肺炎链球菌表面蛋白PspA的DNA编码序列的3’端引入终止信号TAA和酶切位点XhoI后化学合成全基因序列，所述化学合成的全基因序列连于载体pUC57上，记为PspA’；将PspA’按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，以低温表达的方式，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni²⁺亲和层析法纯化可溶性重组人肺炎链球菌PspA蛋白；

2)筛选抗人肺炎链球菌表面蛋白阳性杂交瘤细胞株：

a)制备免疫脾细胞：以步骤1)所制重组人肺炎链球菌PspA蛋白为抗原，免疫8周龄的BALB/c小鼠5只，设2只不作免疫小鼠做阴性对照；初次免疫抗原加等量弗氏完全佐剂充分乳化后，背部皮下多点注射免疫小鼠，100μg/小鼠；之后间隔三周用相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射进行第二次免疫，以后间隔2周用相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射进行第三次免疫；第三次免疫15天后尾静脉采血，检测抗血清效价；取小鼠脾脏，用RPMI-1640洗液冲洗后，用吸有5ml RPMI-1640培养基注射器针头穿刺脾脏小心的洗出脾细胞，然后过筛，使脾细胞尽可能都通过网孔挤压到溶液中，将脾细胞悬液移入离心管中，1100rpm离心5min，弃上清，离心洗涤两次；用RPMI-1640培养液轻轻将脾细胞重悬，计数，备用；

b)细胞融合：将含1×10⁸个脾细胞的悬液和含1×10⁷个骨髓瘤细胞的悬液混合，补加培养基洗液至40ml，充分混匀；1200rpm离心5分钟，弃去上清；使细胞团块松散均匀呈糊状；取出已配好的50％PEG、RPMI-1640洗液，放在37℃水浴中，预温备用；所述PEG是MW1450；吸取50％的PEG 0.8ml，缓慢加入离心管边加边搅拌，时间控制在60秒±5秒；然后再用60秒的时间逐渐加入40ml预热好的RPMI-1640洗液，使PEG稀释而失去促融作用；室温离心融合细胞，1000rpm离心5min，弃上清；加入HAT培养液，轻轻吹吸、重悬沉淀细胞；将融合细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔培养板内，50μl/孔，然后将培养板置37℃、5％CO₂的培养箱中培养；

c)阳性克隆的筛选和克隆化培养：融合后第3天开始，每天观察各孔细胞生长情况，若有污染，立即用叠氮钠处理；融合后第7d用HT培养液全换液；换液后第二天，吸取出现克隆的孔上清用于特异性检测；将检测到有强阳性的孔，用有限稀释法进行亚克隆和克隆，经过3次克隆化操作后，所有的克隆化细胞孔检测阳性率为100％，即可确定已获得了分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

3.一种人肺炎链球菌表面蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述人肺炎链球菌表面蛋白单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株Sp-18#分泌的单克隆抗体。