[发明专利]一种黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性检测方法

说明书

本发明属于磷酸酶活性检测领域，具体涉及一种黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性检测方法，包括以下步骤：将焦磷酸、待测活性的无机焦磷酸酶混合反应，然后加入铜盐，继续反应，得到待测反应液，然后通过黑磷检测铜离子的电化学信号，得到电化学响应信号。本发明中黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性传感技术用于检测焦磷酸酶活性。该方法简单易操作，在均相溶液中操作，使用了与生理条件相一致的天然底物PPi并结合了黑磷纳米材料对铜离子的特异性吸附性质，可以实现对焦磷酸酶的灵敏检测。

技术领域

本发明属于磷酸酶活性检测领域，具体涉及一种黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性检测方法。

背景技术

酶是决定生物系统化学转化模式的重要分子器件。几乎在所有的生物体中，酶促反应都起着非常重要的作用，即使在单个细胞中，也存在数千种酶促反应为生物体正常的代谢和繁殖提供资源和能量。无机焦磷酸酶（PPase，一种普遍存在的水解酶），它可以特异催化一分子焦磷酸盐（P₂O₇^4-，PPi）转化为两个磷酸盐分子（PO₄^3-，Pi）。PPase酶催化PPi水解反应是一种高能放电反应，因此，它可以被用于一些能量不良的生化反应，以推动或补充这些反应。另外，PPase还被报道与一些生物反应（如脂肪合成与降解、磷代谢、碳水化合物代谢、DNA合成、钙吸收、骨形成）和临床疾病（如肺腺癌、甲状腺机能亢进、结直肠癌）的关系。

传统的检测PPase的方法主要是通过对已释放的Pi进行分析，或者使用放射性标记的PPi模拟天然底物，但这些方法耗时，费力，灵敏度低。后又有人提出用比色/荧光分析检测PPase的活性，但是这些方法往往涉及标记策略。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性检测方法。

本发明所采取的技术方案如下：一种黑磷介导铜离子聚集的电化学信号转换的磷酸酶活性检测方法，包括以下步骤：将焦磷酸、待测活性的无机焦磷酸酶混合反应，然后加入铜盐，继续反应，得到待测反应液，然后通过黑磷检测铜离子的电化学信号，得到电化学响应信号。

由于黑磷纳米材料对铜离子有极强的特异性吸附作用，因此，我们提出了一种基于黑磷-酶水解诱导铜离子释放的半均相电化学策略用于检测焦磷酸酶活性。当目标物焦磷酸酶不存在时，焦磷酸与铜离子之间强的相互作用，使得反应液中的铜离子不能吸附在滴涂有黑磷纳米片的玻碳电极上，因此，检测到极低的铜离子电化学信号；反之，当焦磷酸酶存在时，焦磷酸酶可以催化底物焦磷酸水解，抑制了焦磷酸-铜离子复合物的形成，反应液中的铜离子可以有效的吸附在滴涂有黑磷纳米片的玻碳电极表面，检测到极强的铜离子电化学信号。本发明中提到的这种方法，铜离子的电化学信号与焦磷酸酶的浓度呈现正相关，且可以有效监测外部因素对焦磷酸酶活性的抑制效应。这种方法操作简单，无需标记和复杂的操作，对焦磷酸酶活性检测的选择性高，灵敏度高，有望应用于临床诊断与焦磷酸酶相关的疾病及探究焦磷酸酶在生物体系中的作用机制。

通过黑磷检测铜离子的电化学信号采用滴涂黑磷纳米材料的玻碳电极检测，所述滴涂黑磷纳米材料的玻碳电极通过以下过程得到：将黑磷纳米片置于超声仪中超声1-3h，然后加5-15 V电压，电解黑磷纳米片溶液15-45min，然后再置于超声仪中超声1-3h，得到黑磷溶液，取黑磷溶液滴在玻碳电极上，干燥后得到滴涂黑磷纳米材料的玻碳电极。对黑磷溶液进行超声-电解-超声的目的是剥离黑磷纳米片

将所述的待测反应液滴加到滴涂黑磷纳米材料的玻碳电极表面，反应至少4h，然后洗去反应液，吹干，置于含有KNO₃的缓冲液中测方波伏安法，电势窗口选择为-0.3 V-0.2 V，电位跃为4 mV，振幅为25 mV，频率为25 Hz。