[发明专利]一种鸡传染性支气管炎病毒含量的测定方法

权利要求书

1.一种鸡传染性支气管炎病毒(IBV)含量测定方法，具体包含如下实验步骤：

1)10倍系列稀释IBV，将不同稀释倍数的IBV分别接种10～11日龄鸡胚；

2)将接种后的鸡胚继续孵育48-60h，分别收获尿囊液并提取RNA；

3)用荧光定量PCR法测定RNA中IBV的含量，并结合荧光定量PCR的标准曲线判定各受试鸡胚的IBV感染情况；

4)根据受试鸡胚的感染情况，计算EID₅₀。

2.根据权利要求1中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的荧光定量PCR的标准曲线是通过以下步骤制备的：

1)利用IBV国标引物对M基因进行PCR扩增并进行测序验证；

2)将测序验证无误的M基因克隆至原核载体构建成质粒；

3)将上述质粒进行体外反转录制备获得标准RNA；

4)10倍系列稀释标准RNA并以之作为模板进行荧光定量PCR反应，以模板的浓度和Ct值，绘制出荧光定量标准曲线。

3.根据权利要求1或2中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的荧光定量PCR的反应参数为：

反转录反应：42℃5min，95℃，10s，1循环；

PCR反应：95℃，5s，60℃，20S，40个循环，末点收集荧光信号。

4.根据权利要求1或2中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的荧光定量PCR的引物和探针为：

引物：M-N-F：5’-ATGTCTTTAGGCAAGTGGTCTGG-3’(SEQ ID NO.1)

M-N-R：5’-GAATCTAACGCCGTAGGTTCAATA-3’(SEQ ID NO.2)

荧光探针：5’-GCAAGCCACTGACCCTCACAATAAAGA-3’(SEQ ID NO.3)

荧光探针的5’端标记为荧光报告基团FAM，3’端标记为荧光报告基团为TAMRA。

5.根据权利要求1中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的IBV感染鸡胚后无明显的临床症状。

6.根据权利要求1或5中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的IBV为天津渤海农牧产业联合研究院有限公司提供的IBV 4/91株。

7.根据权利要求1中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的鸡胚为SPF鸡胚。

8.根据权利要求1中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的10倍系列稀释IBV是指将IBV进行10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹倍稀释。

9.根据权利要求1中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的接种是指给每只鸡胚注射0.1ml稀释好的不同浓度的IBV。

10.根据权利要求2中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的原核载体是pMD18-T载体。