[发明专利]一种鸡传染性支气管炎病毒含量的测定方法

说明书

本发明提供了一种鸡传染性支气管炎病毒含量的检测方法，该方法使用荧光定量PCR法来检测病毒的含量，并结合荧光定量PCR的标准曲线来确定鸡胚的感染情况判定EID₅₀。本方法可针对鸡胚被感染后无临床症状或症状不明显的病毒进行定量检测，克服了传统EID₅₀无法准确客观测定不能引起临床病变的病毒含量的不足。

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体是涉及兽用病毒含量检测领域。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性、病毒性呼吸道传染病，它可以侵害肾脏和泌尿生殖系统，引起雏鸡死亡，还可使感染鸡生长受阻，产蛋量和蛋品质下降，死淘率增加，给养禽业造成严重的经济损失。

目前，疫苗免疫是防治IB的主要方法。在兽用生物制品生产中,常用病毒半数感染量(EID₅₀)来表示病毒类疫苗及其半成品抗原的效价，在实际生产过程中，疫苗生产厂家也常用EID₅₀来衡量活疫苗的活性，并用于定期对产品进行质检，或者出场检验。EID₅₀测定过程中的关键技术在于，如何快速、有效、准确的确定受试胚胎是否被病毒感染。传统的EID₅₀测定是通过观察胚胎病变和称重来确定感染与否，由于受试胚胎存在个体差异，加之实验人员的评判带有主观性，尤其是在测定病毒感染的临界值时，传统的EID₅₀测定方法更加难以保证测试结果的准确性和客观性。除此之外，绝大多数IBV灭活疫苗及部分血清型的IBV感染鸡胚后，存在不能引起鸡胚病变或病变不明显的现象，根本不能利用传统的EID₅₀测定方法来完成病毒定量和疫苗质检的工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能通过病毒半数感染量(EID₅₀)来快速、准确、客观测定IBV含量的方法。

本发明的目的还在于提供一种在(EID₅₀)测定过程中，由于病毒特定的理化特性导致被感染胚胎无症状或症状不明显时，如何确定其是否被感染的方法。

本发明技术方案的优点在于：特异性强，灵敏度高，检测时间短，测试结果客观合理可信度高。

为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种鸡传染性支气管炎病毒(IBV)含量测定方法，具体包含如下实验步骤：

1)10倍系列稀释IBV，将不同稀释倍数的IBV分别接种10～11日龄鸡胚；

2)将接种后的鸡胚正常孵育48-60h，分别收获尿囊液并提取RNA；

3)用荧光定量PCR法测定RNA中IBV的含量，并结合荧光定量PCR的标准曲线判定各受试鸡胚的IBV感染情况；

4)根据受试鸡胚的感染情况，计算EID₅₀。

进一步的，所述的荧光定量PCR的标准曲线是通过以下步骤制备的：

1)利用IBV国标引物对M基因进行PCR扩增并进行测序验证；

2)将测序验证无误的M基因克隆至原核载体构建成质粒；

3)将上述质粒进行体外反转录制备获得标准RNA；

4)10倍系列稀释标准RNA并以之作为模板进行荧光定量PCR反应，以模板的浓度和Ct值，绘制出荧光定量标准曲线。