[发明专利]一种人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法及其产品

权利要求书

1.一种人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法，其特征在于：包括，

GnT-II的原核表达：在大肠杆菌中表达人源的GnT-IIΔTM，所述GnT-IIΔTM为截掉N端1～87个氨基酸的人源N-乙酰葡糖胺转移酶II；

GnT-II的纯化：将原核表达的所述GnT-IIΔTM进行纯化；

具体步骤如下：将GnT-II编码基因中编码N端1～87个氨基酸的多核苷酸截去，构建原核表达载体；

转化原核宿主菌，涂布于平板培养基，过夜；

筛选宿主菌单菌落，接种于LB液体培养基，振荡培养过夜，得菌液；

将所述菌液接种于TB液体培养基，振荡培养，再降温培养；

加入诱导剂，振荡培养，离心收集菌体，重悬于缓冲液中，超声破碎，离心，收集上清液；

用所述缓冲液清洗亲和层析柱，将所述上清液上样，收集洗脱液，即得人源N-乙酰葡糖胺转移酶II。

2.如权利要求1所述人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法，其特征在于：所述GnT-II为GnT-IIΔTM，aa 88-443；所述原核表达载体为pET28a-GnT-IIΔTM；所述转化原核宿主菌为ROSETTA。

3.如权利要求1或2任一所述人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法，其特征在于：所述平板培养基为LB、卡那霉素和氯霉素平板培养基；所述LB液体培养基为LB、卡那霉素和氯霉素液体培养基；所述TB液体培养基为TB、卡那霉素和氯霉素液体培养基；所述缓冲液为Tris-HCl、NaCl缓冲液；所述诱导剂为IPTG；所述亲和层析柱为镍离子亲和层析柱。

4.如权利要求3所述人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法，其特征在于：所述缓冲液，其Tris-HCl、NaCl浓度分别为25mM，150mM。

5.如权利要求1、2或4任一所述人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法，其特征在于：所述诱导剂浓度为0 .1mM。

6.如权利要求5所述人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法，其特征在于：所述缓冲液的pH为8 .0。

7.如权利要求1、2或6所述人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法，其特征在于：所述接种于LB液体培养基，振荡培养过夜，其培养温度为37℃；所述将菌液接种于TB液体培养基，振荡培养，再降温培养，其温度为37℃，其振荡速率为200r/min，其振荡时间为3h，其降低温度至16℃，其降温培养时间为1h；所述加入诱导剂，振荡培养，其振荡培养频率为200r/min，其培养时间为20h；所述离心收集菌体，其离心速率为9000r/min，其离心时间为60min。

8.如权利要求7所述人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法，其特征在于：所述将菌液接种于TB液体培养基，振荡培养，再降温培养，其所得菌液OD600为0.6～0.8。

9.如权利要求1、2或8所述人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法，其特征在于：所述用缓冲液清洗亲和层析柱，上样所述上清液，收集洗脱液，其缓冲液体积与所述亲和层析柱体积比为10∶1，其缓冲液流速为1min/mL。

10.利用权利要求1～9所述方法制备的人源N-乙酰葡糖胺转移酶II，其特征在于：所述人源N-乙酰葡糖胺转移酶II，其米氏常数为55 .98μM。