[发明专利]一种人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法及其产品

说明书

本发明提供了一种人源N‑乙酰葡糖胺转移酶II原核表达方法及其产品，涉及在大肠杆菌中表达人源的GnT‑IIΔTM、GnT‑IIΔTM的纯化、GnT‑IIΔTM的体外活性检测等方面。本发明在大肠杆菌中成功表达并纯化了人源的GnT‑IIΔTM，且该酶在体外具有催化活性，解决了哺乳动物膜蛋白GnT‑II原核表达极易降解、纯化困难的技术问题，可以大量制备GnT‑IIΔTM。获得具有体外活性的重组人源GnT‑II解决了重要寡糖结构Gn2Man3Gn2的酶法合成问题，推动糖化学与糖生物学的发展。

技术领域

本发明属于分子生物学及生物化学技术领域，具体涉及一种人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法及其产品。

背景技术

糖基化是对蛋白质或脂质进行糖(寡糖)的修饰，形成糖复合物的过程，也是真核细胞翻译后修饰的主要形式之一。蛋白质上的N-糖基化修饰直接影响蛋白的结构和功能，具有重要的生理意义。N-寡糖具有多种形式，其生物合成路径由多种糖基转移酶的参与，故糖基转移酶的制备和性质研究是糖科学领域的重要方向之一。N-乙酰葡糖胺转移酶II(即GnT-II)是哺乳动物细胞糖蛋白N-糖链加工的关键酶之一，催化复合型N-糖链的形成。

目前人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的表达只在昆虫细胞、动物细胞及酵母细胞表达体系中成功实现，其中昆虫细胞与动物细胞表达的蛋白完成了纯化，然而其产量很低且耗资较大。GnT-II蛋白的体外大量活性表达至今未见报道。原核表达系统，如大肠杆菌，具有产量高、干扰蛋白少等优点，是理想的体外大量表达重组GnT-II蛋白的体系。然而至今还未曾有大肠杆菌表达人源GnT-II的报道，主要原因是GnT-II为高尔基体驻留的哺乳动物膜蛋白，在原核体系中存在易降解等问题，难以表达纯化。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法，其包括，

GnT-II的原核表达：在大肠杆菌中表达人源的GnT-IIΔTM，所述GnT-IIΔTM为截掉N端1～87个氨基酸的人源N-乙酰葡糖胺转移酶II；

GnT-II的纯化：将原核表达的所述GnT-IIΔTM进行纯化；

将GnT-II的N端1～87个氨基酸截去，构建原核表达载体；

转化原核宿主菌，涂布于平板培养基，过夜；

筛选宿主菌单菌落，接种于LB液体培养基，振荡培养过夜，得菌液；

将所述菌液接种于TB液体培养基，振荡培养，再降温培养；

加入诱导剂，振荡培养，离心收集菌体，重悬于缓冲液中，超声破碎，离心，收集上清液；

用所述缓冲液清洗亲和层析柱，将所述上清液上样，收集洗脱液，即得人源N-乙酰葡糖胺转移酶II。

作为本发明所述人源N-乙酰葡糖胺转移酶II的原核表达方法的一种优选方案：所述GnT-II为GnT-IIΔTM，aa 88-443；所述原核表达载体为pET28a-GnT-IIΔTM；所述转化原核宿主菌为ROSETTA。