[发明专利]使用胎盘间充质干细胞治疗卵巢早衰的方法和细胞制剂

权利要求书

1.一种细胞制剂，其是通过使胎盘间充质干细胞混悬于0.9%氯化钠溶液中配制成的细胞混悬液，细胞浓度为1~10×10⁶个细胞/ml，所述0.9%氯化钠溶液中还添加葡萄糖酸镁和磷脂，添加葡萄糖酸镁的量是使镁离子浓度为5mmol/L，添加磷脂的浓度为0.2mg/ml；该细胞制剂是通过包括如下步骤的方法制得的：将细胞传代所得间充质干细胞转移至离心管中，离心，弃上清，加入包含葡萄糖酸镁和磷脂的0.9%氯化钠溶液重悬，制得细胞制剂；所述间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm³左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；所述的组织清洗液是包含1%双抗的0.9%生理盐水；

(2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15~30ml混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；

(3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min；移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；

(4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；

(5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO₂培养箱中以37℃、5%CO₂、饱和湿度的条件下培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm²时可进行接下来的传代；所述完全培养基是包含10%FBS的DMEM-F12培养基；

(6)细胞传代：取P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000~12000个细胞/cm²，置CO₂培养箱以37℃、5%CO₂、饱和湿度的条件下培养至细胞密度达90%以上，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。

2.根据权利要求1的细胞制剂，其中细胞浓度为1~5×10⁶个细胞/ml。

3.根据权利要求1的细胞制剂，其中细胞浓度为1~3×10⁶个细胞/ml。

4.根据权利要求1的细胞制剂，步骤(2)中，所述的混合酶消化液中包含：15~30体积的Hank’s平衡盐溶液、0.2~0.6体积的Liberase MNP-S酶、0.2~2体积的DNA I型酶。

5.根据权利要求1的细胞制剂，步骤(4)中，所述冻存液的配方为：65%的DMEM-F12、15%的人血清白蛋白、20%的DMSO。