[发明专利]一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法

权利要求书

1.一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞系的获取；

S2.向获取的细胞转染Lal，培养24小时；

S3.向转染Lal后的细胞培养基中加入丙氨酸和谷氨酰胺，反应2-4小时，离心收集细胞，然后将细胞破碎，离心，获取细胞裂解液；

S4.收集S3中含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的细胞裂解液，并提取L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。

2.根据权利要求1所述一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，S2所述细胞转染Lal的操作步骤如下：

S1.当HEK293T细胞生长状态良好且贴壁细胞密度达到50-70％即可进行转染；

S2.转染前1h换液，移去旧培养基加入9mL新鲜无抗培养基；

S3.取一干净的2mL离心管，依次加入灭菌去离子水和10μg质粒，使终体积达到450μL，加入50μL CaCl₂，使三者混合均匀，将500μL的2×HBSS缓慢滴加至上述溶液中，边滴加边摇匀；

S4.取出细胞培养皿，加入5μL氯喹，然后缓慢加入S3混合好的转染液，轻轻摇匀，放回细胞培养箱。

3.根据权利要求2所述一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述质粒为去内毒素质粒，所述质粒的构建过程包括制备线性化载体、插入片段扩增引物设计及插入片段PCR扩增、PCR产物的酶切及回收、进行重组反应、反应产物转化、涂板、克隆鉴定、去内毒素质粒的提取。

4.根据权利要求3所述一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述线性化载体根据pcDNA3质粒图谱，选定Hind III和EcoRI两个酶切位点进行酶切制备得到。

5.根据权利要求4所述一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述线性化载体制备具体过程为：向PCR管中加入Hind III 1μL、EcoRI 1μL、10×K Buffer 2μL、空载体10μL，添加ddH₂O补至终体积为20μL，37℃酶切5h。

6.根据权利要求3所述一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述PCR扩增引物为

上游引物：

5’-GATTACAAGGACGACGATGACAAGACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATTAGCATTTTAATA-3’；

下游引物：5’-TATGACCATGATTACGAATTCTTATTTGAGAGAACA-3’。

7.根据权利要求3所述一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，59℃退火5s，72℃延伸1min；以上步骤循环35次，然后72℃末尾延伸5min，4℃保存。

8.根据权利要求3所述一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，S1所述过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞系通过细胞电转，然后G418筛选后获得。