[发明专利]一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法

说明书

本发明提供一种制备L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺的方法，包括以下步骤：S1.过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞系的获取；S2.向获取的细胞转染Lal，培养24小时；S3.向转染Lal后的细胞培养基中加入丙氨酸和谷氨酰胺；S4.收集S3中的细胞裂解液，并提取L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺。本发明操作简单快速，污染小，绿色环保，从提高反应底物浓度和生物反应器数目两方面来提高该酶促反应的效率，可提高L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺的产量。

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法。

背景技术

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺属于氨基酸的衍生物，分子式为C₈H₁₅N₃O₄，分子量为217，是目前国内外比较热门的氨基酸二肽产品，简称丙谷二肽，它是肠外营养的一个组成部分，适用于需要补充谷氨酰胺的病人，包括处于分解代解和高代谢状况的病人，是人体含量最丰富的氨基酸谷氨酰胺的理想替代品，因此在保健品和药用领域非常广泛。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶解度很高，是同样条件下游离谷氨酰胺的200倍，而且性质稳定，在不同的pH值条件下加热灭菌也不会产生有毒的焦谷氨酸和氨产生，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺进入机体之后，被许多器官组织中的二肽酶快速有效地分解为丙氨酸和谷氨酰胺，满足机体的需求，无任何毒副反应。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的半衰期极短，约3.8分钟，并且进入机体后仅有微量的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺从尿中排出，这表明L-丙氨酰-L-谷氨酰胺可被机体有效地利用，避免了因L-丙氨酰-L-谷氨酰胺积蓄可能引起的损伤，因此L-丙氨酰-L-谷氨酰胺在临床上受到了广泛的应用。

目前，生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法有化学合成法、微生物发酵法以及微生物转化法。由于化学合成法在合成过程中需要引入和去除保护基团，合成步骤过多，成本过高，并且需要用到有毒试剂，不适合工业生产；微生物发酵法成本低廉，环境温和，但是产量较低，离大规模生产还有一定距离；随着DNA重组技术的发展以及微生物资源的发现，使得微生物转化法生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺成为工业上很有前景的生产方法。其中微生物转化法生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺大多采用大肠杆菌作为生物反应器进行酶法合成，但其有个明显的的缺点：过表达Lal(L-型氨基酸连接酶，L-amino acid α ligase)大肠杆菌的存活率低，导致最终的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺产量低。

专利申请CN104480172A公开了一种利用重组大肠杆菌生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，通过将具有氨基酸酯酰基转移酶活性的蛋白质的基因片段重组到载体上并转入微生物细胞，得到的具有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成活性的重组微生物。上述方案虽然一定程度上增加了L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产量，但未考虑大肠杆菌的存活率及酶反应过程中的底物从浓度问题，从而使该反应的效率低下。

发明内容

本发明针对现有技术的上述缺陷，提供一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，考虑提高酶促反应最重要的条件之一底物浓度，来提高反应效率，从而提高L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产量。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，包括以下步骤：

S1.过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞系的获取；

S2.向获取的细胞转染Lal，培养24小时；

S3.向转染Lal后的细胞培养基中加入丙氨酸和谷氨酰胺，反应2-4小时，离心收集细胞，然后将细胞破碎，离心，获取细胞裂解液；

S4.收集S3中的细胞裂解液，并提取L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。