[发明专利]一种南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白的原核表达、多克隆抗体的制备及应用在审
| 申请号： | 201811570318.8 | 申请日： | 2018-12-21 |
| 公开（公告）号： | CN109536522A | 公开（公告）日： | 2019-03-29 |
| 发明（设计）人： | 李向阳;谢鑫;孙涛;蒋君梅 | 申请（专利权）人： | 贵州大学;重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/46;C07K16/10;C07K16/06;G01N33/569 |
| 代理公司： | 贵阳中新专利商标事务所 52100 | 代理人： | 张行超 |
| 地址： | 550025 贵州省*** | 国省代码： | 贵州;52 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 多克隆抗体 南方水稻黑条矮缩病毒 原核表达 制备 蛋白 南方水稻黑条矮缩病 构建重组质粒 大肠杆菌 病毒 定量检测 技术支持 检测结果 理论支撑 免疫接种 设计引物 外壳蛋白 预测预警 植物组织 反转录 扩增 应用 水稻 检测 | ||
1.一种南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白的原核表达方法，包括以下步骤：
(1)提取南方水稻黑条矮缩病毒的RNA；
(2)将RNA反转录为cDNA；
(3)以cDNA为模板扩增SRBSDV的P6外壳蛋白基因，得P6外壳蛋白基因的扩增产物与原核表达载体pET-28a；
(4)构建重组原核表达质粒pET-28a-P6
对P6外壳蛋白基因的扩增产物与原核表达载体pET-28a分别进行酶切，回收酶切产物，并将酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选、鉴定，获得构建正确的重组质粒pET-28a-P6；
(5)P6蛋白的表达和纯化
将重组质粒pET-28a-P6转化大肠杆菌细胞，筛选阳性克隆，诱导培养，裂解细胞，离心收集沉淀，洗涤得粗提蛋白，再经蛋白纯化系统纯化和脱盐，得到纯化后的蛋白。
2.根据权利要求1所述的南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白的原核表达方法，其特征在于：在步骤(3)中，以cDNA为模板，利用以下引物扩增SRBSDV的P6外壳蛋白基因，引物序列如下：
上游引物：CG
下游引物：GC
上下游引物分别如SEQ ID NO.1、2所示。
3.根据权利要求1所述的南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白的原核表达方法，其特征在于：在步骤(4)中，对P6外壳蛋白基因的扩增产物与原核表达载体pET-28a分别采用BamHI和XhoI酶进行酶切。
4.一种南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：用权利要求1中纯化后的P6蛋白免疫动物，分离血清，得到蛋白多克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：免疫的动物为新西兰大耳兔。
6.如权利要求4所述南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白多克隆抗体在检测植物组织SRBSDV病毒含量的应用。
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