[发明专利]一种南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白的原核表达、多克隆抗体的制备及应用

说明书

本发明公开了一种南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白的原核表达、多克隆抗体的制备方法，该方法包括提取南方水稻黑条矮缩病毒的RNA、反转录cDNA、设计引物扩增其P6外壳蛋白、构建重组质粒、大肠杆菌原核表达、免疫接种、制备多克隆抗体等步骤。本发明还公开了一种所述南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白多克隆抗体在检测植物组织SRBSDV病毒含量的应用。本发明多克隆抗体具有检测结果可靠，可对水稻不同组织中的病毒含量进行定量检测，从而为南方水稻黑条矮缩病的预测预警及科学防控提供技术支持和理论支撑。

技术领域

本发明涉及一种南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白的原核表达、多克隆抗体的制备及应用，属于生物技术领域。

背景技术

南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)属呼肠病毒科，斐济病毒属，是水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf disease，RBSDV)的同属病毒。我国首先于2001年在广东省阳江市的水稻上发现SRBSDV，随后在我国海南、江西、云南和贵州等地区大面积发生，该病毒病严重时导致部分田块病株率达80％以上，造成大面积失收。南方水稻黑条矮缩病毒病和水稻黑条矮缩病毒病在水稻等作物上引起的病害症状、病毒粒子、地理分布及寄主范围方面等都极其相似。目前，SRBSDV引起的南方水稻黑条矮缩病毒病已成为水稻上的一种上升性病害，严重影响水稻安全生产。

SRBSDV编码13种蛋白，其中，6种结构蛋白(P1,P2,P3,P4,P8,P10)和7种非结构蛋白(P5-1,P5-2,P6,P7-1,P7-2,P9-1,P9-2)。与其它斐济病毒属病毒同源性比对和分析：推测出13个蛋白的功能。S1编码的结构蛋白P1大小约169kDa，具有典型的RdRp(RNA-dependent RNA Polymerase)基因序列；S2编码的大小约141kDa病毒核心衣壳蛋白P2；S3编码大小约135kDa的蛋白P3，是一种加帽酶；S4编码大小约132kDa的蛋白P4，为病毒外壳B型刺突蛋白；S5-1编码的P5-1蛋白可能参与病毒原质的形成；S6编码大小约90 kDa的蛋白P6，SRBSDV S6与RBSDV S6的核苷酸的同源率为70.6％，RBSDV S6编码的P6蛋白能够干扰DNA甲基化和寄主的防御系统，表明P6是一种沉默抑制子；S7分别编码大小约40.9 kDa蛋白P7-1和36.2 kDa蛋白P7-2；P7-1可以形成包裹病毒粒体的管状结构。利用Sf9杆状病毒表达系统和BiFC实验证明SRBSDV P7-1蛋白具有独立诱导形成小管结构的能力；S8编码大小约68kDa的蛋白P8，为病毒的核心衣壳蛋白；S10编码病毒的外层衣壳蛋白。

为了解和掌握水稻发病状况，加强对我国南方水稻黑条矮缩病的早期监测和预警，急需建立针对水稻SRBSDV的检测方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高产率、易纯化、低成本的一种南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白的原核表达方法。

本发明的另一目的是提供一种特异性好、效价高的南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白多克隆抗体的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白多克隆抗体在检测植物组织SRBSDV病毒含量的应用。

本发明的技术方案是：一种南方水稻黑条矮缩病毒P6蛋白的原核表达方法，包括以下步骤：

(1)提取南方水稻黑条矮缩病毒的RNA；

(2)将RNA反转录为cDNA；

(3)以cDNA为模板扩增SRBSDV的P6外壳蛋白基因，得P6外壳蛋白基因的扩增产物与原核表达载体pET-28a；

(4)构建重组原核表达质粒pET-28a-P6