[发明专利]一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法在审
| 申请号： | 201811571362.0 | 申请日： | 2018-12-21 |
| 公开（公告）号： | CN109439615A | 公开（公告）日： | 2019-03-08 |
| 发明（设计）人： | 龚婷;王维勇;袁超;朱晓锋;徐永健;蒙利洁;宋林锦 | 申请（专利权）人： | 贵州大学 |
| 主分类号： | C12N5/071 | 分类号： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 贵阳东圣专利商标事务有限公司 52002 | 代理人： | 兰艳文 |
| 地址： | 550025 贵州省*** | 国省代码： | 贵州;52 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 睾丸间质细胞 香猪 差速离心 高纯度 差速贴壁法 胶原酶消化 细胞悬浮液 功能提供 技术指导 间质细胞 原代培养 睾丸组织 性早熟 猪睾丸 富集 性状 消化 重复 研究 | ||
1.一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）用胶原酶消化香猪睾丸组织块以获得细胞悬浮液：
胶原酶选择I型胶原酶或II型胶原酶或IV型胶原酶；
胶原酶浓度为0.03%-0.3%之间；
胶原酶消化液与睾丸组织之间体积比为3：1到8：1；
胶原酶消化时间为15min-60min；
（2）0.25%Trypsin-EDTA重复消化获得睾丸间质细胞；
（3）差速离心法富集睾丸间质细胞：差速离心法至少包括3次离心，第一次800rpm-1200rpm，时间3-8min,第二次和第三次为600rpm-1000rpm，时间为3-8min；
（4）差速贴壁法纯化睾丸间质细胞：差速贴壁法培养包括两次细胞培养，其中第一次持续时间4-12h，第二次持续时间为12-24h；第一次、第二次细胞培养条件均为37℃，5%CO2；第一、第二次所采用的培养基均为DMEM/F12，胎牛血清含量均为DMEM/F12培养基体积的10%，双抗含量均为DMEM/F12培养基体积的1%。
2.如权利要求1所述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述步骤（1）之前：获得睾丸组织后，先剥离附睾、血管、结缔组织、白膜及明显的生精小管，然后将睾丸组织处理成尽可能小的碎块。
3.如权利要求1所述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述步骤（1）优选I型胶原酶消化睾丸组织；优选胶原酶浓度为0.1%；优选胶原酶消化液与睾丸组织之间体积比为5：1；优选37℃水浴消化50min。
4.如权利要求1所述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述步骤（2），首先采用纱布过滤消化后的细胞悬液，过滤后的细胞悬液经离心后加入0.25%Trypsin-EDTA置于细胞培养箱消化10min,充分把消化后的细胞团消化为单个悬浮细胞，进行终止消化；将细胞悬液依次过200目及400目细胞钢筛，去除尚未被消化或消化不完全的睾丸组织及其他组织，由此实现睾丸组织的充分消化及睾丸间质细胞的充分分离。
5.如权利要求1所述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述步骤（3）的差速离心法包括四次离心，第一次离心为1000rpm、8min，并在此步加入红细胞裂解液，冰浴裂解20min；第二次900rpm离心8min,第三次800rpm离心5min，第四次750rpm离心5min；细胞计数后以4x106个细胞/mL的密度接种培养。
6.如权利要求1所述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述步骤（4）差速贴壁法培养的第一次细胞培养持续时间为6h，第二次细胞培养持续时间为24h。
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