[发明专利]一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法

说明书

本发明公开了一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）用胶原酶消化香猪睾丸组织块以获得细胞悬浮液：（2）0.25%Trypsin‑EDTA重复消化获得睾丸间质细胞；（3）差速离心法富集睾丸间质细胞：差速离心法至少包括3次离心，第一次800rpm‑1200rpm，时间3‑8min,第二次和第三次为600rpm‑1000rpm，时间为3‑8min；（4）差速贴壁法纯化睾丸间质细胞。本发明与现有的猪睾丸间质细胞原代培养及纯化方法相比，其操作更为简单高效，并且获得了数量多、活性强、纯度高的贵州香猪睾丸间质细胞。本发明可为深入研究贵州香猪性早熟性状及睾丸间质细胞相关功能提供有效的技术指导。

技术领域

本发明属于原代细胞培养及纯化领域，具体地涉及一种获得高纯度香猪睾丸间质细胞原代培养的方法。

背景技术

睾丸间质细胞（Leydig cell,LC）分布于生精小管之间的结缔组织中，胞体呈椭圆形和不规则形状，主要负责合成分泌睾酮。睾酮是促进雄性动物内外生殖器官发育、精子发生、维持第二性征的重要雄激素，血清内睾酮的95%由睾丸间质细胞分泌，睾酮与相应的靶器官受体作用后发挥重要的生理功能。因此，建立一种方便快捷、稳定高效的睾丸间质细胞的原代培养及纯化方法，对深入研究动物睾丸间质细胞在动物生殖生理活动中的相关功能具有重要意义。

睾丸间质细胞的分离培养研究已有较多研究，例如在羊、牛、鼠及猪等动物上，主要的方法是采用胶原酶消化、Perco ll连续密度梯度法分离纯化培养原代睾丸间质细胞。本发明人前期也拟采用Percoll法培养纯化香猪睾丸间质细胞，结果显示，Percoll梯度离心柱难以稳定制备，离心后的间质细胞层主要集中在50%-70%Percoll浓度层，但台盼蓝染色后活率较低，细胞生长缓慢。

综上，本领域需要一种简单快速、稳定高效的培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，该方法获得的睾丸间质细胞不仅要数量多，活率强，而且要纯度高。建立这样的方法，可解决睾酮合成分泌的体外细胞模型建立的问题，为研究贵州香猪性早熟特性及相关生殖生理的分子机制提供良好的试验基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，该方法可以获得数量多、活性强、纯度高的贵州香猪原代睾丸间质细胞。

本发明的目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，包括以下步骤：

（1）用胶原酶消化香猪睾丸组织块以获得细胞悬浮液：

胶原酶选择I型胶原酶或II型胶原酶或IV型胶原酶；

胶原酶浓度为0.03%-0.3%之间；

胶原酶消化液与睾丸组织之间体积比为3：1到8：1；

胶原酶消化时间为15min-60min；

（2）0.25%Trypsin-EDTA重复消化获得睾丸间质细胞；

（3）差速离心法富集睾丸间质细胞：差速离心法至少包括3次离心，第一次800rpm-1200rpm，时间3-8min,第二次和第三次为600rpm-1000rpm，时间为3-8min；

（4）差速贴壁法纯化睾丸间质细胞：差速贴壁法培养包括两次细胞培养，其中第一次持续时间4-12h，第二次持续时间为12-24h；第一次、第二次细胞培养条件均为37℃，5%CO2；第一、第二次所采用的培养基均为DMEM/F12，胎牛血清含量均为DMEM/F12培养基体积的10%，双抗含量均为DMEM/F12培养基体积的1%。