[发明专利]一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体及其制备方法

说明书

本发明公开了一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体及其制备方法，涉及纳米基因转运体制备领域，基因载体包括电中性或电负性的水溶性多糖、阳离子聚合物、带负电的基因和交联剂；电中性或电负性水溶性多糖与阳离子聚合物构成多糖基接枝交联聚合物，多糖基接枝交联聚合物与带负电的基因通过静电作用形成多层级自组装的基因载体，带负电的基因负载于基因载体内部，电中性或电负性水溶性多糖位于基因载体表面；本发明提供的制备方法绿色、无污染、产量高，合成高效便捷，得到的纳米粒子粒径均一，在50nm‑300nm之间，在肿瘤的基因编辑和免疫治疗应用方面具有广阔的前景。

技术领域

本发明涉及纳米基因转运体制备领域，尤其涉及一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体及其制备方法。

背景技术

基因载体作为基因治疗的有力工具，一直是人们研究的热点。尤其在肿瘤治疗领域，纳米颗粒由于其纳米尺度，可基于EPR效应被靶向定位到肿瘤位置，因此是肿瘤治疗基因载体的首选。纳米粒子容易通过细胞膜进入细胞，能够有效负载和保护抗肿瘤治疗基因进入细胞并在细胞内释放，提高运送效率和生物利用度。

目前的基因载体可分为病毒载体和非病毒载体，其中主要的非病毒基因载体有阳离子脂质体、阳离子聚合物等。常见的阳离子聚合物基因载体如聚乙烯亚胺(PEI)和聚赖氨酸(PLL)等，它们的工作原理是通过静电作用将带负电的基因压缩并形成纳米颗粒，然后通过细胞内吞机制将基因运输到细胞内。然而阳离子聚合物由于其表面携带的正电荷，在体循环过程中会与带负电的血细胞结合而增加凝血风险，同时阳离子载体在体循环中还很容易被网状内皮系统清除，从而限制了其临床应用。因此，如何屏蔽基因载体表面的正电荷是提高阳离子聚合物基因载体安全性的重要手段之一。另一方面，基因载体内部的阳离子聚合物和基因静电凝聚体对基因的有效包封及可控释放对于实现基因在细胞内部的释放和有效表达非常关键，研究表明，相比正常组织，肿瘤细胞内还原性物质积聚，如谷胱甘肽(glutathione，GSH)的浓度最高可达2-20mM。因此，设计一种在正常生理环境中保持稳定，而在细胞内还原环境下降解，从而实现基因在细胞内部的释放和有效表达的基因载体对于其实际应用具有重要意义。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是现有阳离子聚合物基因载体由于其携带的正电荷而导致的细胞毒性及不稳定性，并且不能在细胞内还原环境的影响下分解从而释放出包封在内部的基因。

为实现上述目的，本发明提供了一种基因载体，其实现了对阳离子聚合物正电荷的遮蔽，同时该基因载体内部存在还原环境敏感的二硫键的交联，能够在还原环境下降解，使得基因在细胞内部释放和有效表达，在肿瘤的基因编辑和免疫治疗应用方面具有广阔的前景。

在一个具体实施方式中，基因载体包括多糖、阳离子聚合物、基因和交联剂；多糖为电中性或电负性的水溶性多糖，所述电中性或电负性水溶性多糖与所述阳离子聚合物构成多糖基接枝交联聚合物，所述多糖基接枝交联聚合物与所述基因通过静电作用形成基因载体，所述基因负载于基因载体内部，所述电中性或电负性水溶性多糖位于基因载体表面。

进一步地，交联剂具有还原环境响应性的二硫键。

另一方面，本发明还提供了一种制备上述基因载体的方法，在一个具体实施方式中，包括以下步骤：

(1)制备电中性或电负性水溶性多糖的水溶液，惰性气体保护下加入引发剂，搅拌混匀；

(2)加入阳离子单体或溶于溶剂的阳离子单体，搅拌混匀；

(3)加入还原环境敏感的交联剂，惰性气体保护下进行聚合及交联反应；

(4)透析处理，冷冻干燥得到接枝交联聚合物；

(5)得到的接枝交联聚合物与基因混合，通过静电作用力形成静电凝聚体，即基因载体。