[发明专利]一种快速检测花生过敏原蛋白Ara h2的方法

说明书

本发明公开了一种快速检测花生过敏原蛋白Arah2的方法，本发明将包裹在磁珠/金纳米颗粒/海藻酸盐/氧化石墨烯复合水凝胶中的大鼠嗜碱性白血病（RBL‑2H3）肥大细胞固定在玻碳电极上构建肥大细胞传感器，通过对过敏原蛋白Arah2刺激下肥大细胞的反应进行电化学分析，使用电化学阻抗谱记录和测定过敏原蛋白Ara h2的含量。所开发的细胞传感器对Arah2浓度范围在0.02到0.1ng/mL之间具有较高的检测精度，检测限为8pg/mL。本方法与市售ELISA试剂盒相比检测结果相一致，证明本发明提出的用于检测花生过敏原的方法简单易操作，灵敏度高且检测结果准确可靠，具有十分广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物-电化学领域，具体涉及一种用于快速检测花生过敏原蛋白Arah2的新方法。

背景技术

近年来，食物过敏对公众健康产生了严重威胁，患病率为4%至5%。花生在食品工业中的广泛应用使得花生过敏成为一个主要的健康问题。

目前检测过敏原方法中应用最为广泛的是皮肤试验，它具有快速真实诊断过敏症的特点，但其操作需要对患者皮肤造成一定损伤，检测结果无法定量；而常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）和PCR检测方法的成本高，实验复杂，对操作技术和实验环境要求高，检测结果易存在假阳性。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了一种细胞传感器、其制备方法以及利用该细胞传感器快速检测花生过敏原蛋白Arah2的方法，该细胞传感器以肥大细胞作为传感介质，采用电化学阻抗谱作为指标，突破了常规检测评价的束缚，为快速检测花生过敏原蛋白提供一条崭新的途径。

本发明的一种细胞传感器的制备方法，包括以下步骤：

1）、混合凝胶的制备：将氧化石墨烯与DMEM培养液按质量体积比为0.1g：100mL的比例混合，超声处理4-6min，使得氧化石墨烯均匀地分散在DMEM培养液中得到氧化石墨烯混合液，然后向含有1%海藻酸钠的DMEM培养液中滴加占DMEM培养液质量分数为10%的氧化石墨烯混合液，制得海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶，之后向凝胶中添加纳米磁珠使得凝胶中的纳米磁珠的含量为1mg/mL，得到海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠凝胶，再向凝胶中添加纳米金粒子，使得凝胶中纳米金的含量为0.4mg/mL，得到海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠/纳米金混合凝胶；

2）、肥大细胞RBL-2H3的培养：在37℃、CO₂含量为5％的培养环境中，于含有体积浓度为10％的胎牛血清的DMEM培养基中培养肥大细胞RBL-2H3 2～3天，将肥大细胞与小鼠单克隆Ara h2 IgG1抗体孵育30min，之后收集细胞得到肥大细胞悬浮液；

3）、细胞固定：将细胞悬浮液与混合凝胶按体积比1:1混合，混匀后吸取20μL滴加在电极的表面，然后浸没于CaCl₂溶液中进行固定，固定6min，并置于5％CO₂的37℃培养箱孵育5min，制备得到细胞传感器。

上述制备过程还包括玻碳电极的清洁：将裸电极置于Piranha溶液中浸泡12-18min，之后分别用0.3μm和0.05μm的Al₂O₃抛光粉末将电极表面打磨抛成镜面，再用5%的稀硫酸、无水乙醇、超纯水依次超声清洗5-8min，氮气吹干，4℃条件下储存备用。

本发明还公开了利用上述方法制备得到的细胞传感器以及利用该细胞传感器快速检测花生过敏原蛋白Arah2的方法，具体包括：

取清洁的玻碳电极，滴加细胞传感器后，于CaCl₂溶液中固定5min，之后滴加花生过敏原样品并将电极置于37℃下孵育5min，然后采用交流阻抗法考察工作电极界面的变化，并对电极进行表征，将检测的阻抗值带入标准曲线方程y＝48.82x+1.59(R²＝0 .992)中即可得到样品Ara h2的检测结果。