[发明专利]基于表面增强拉曼光谱检测细胞脱颗粒的方法

权利要求书

1.一种基于表面增强拉曼光谱检测细胞脱颗粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）细胞脱颗粒组分产生并提取：

体外培养肥大细胞，当处于对数生长分裂期时，对其离心和丢弃培养液，用新鲜培养液重悬，调整菌体浓度为10³-10¹⁰个/mL，按10~75%v/v的接种量接种于24孔板或培养皿，培养1-72h；取出后500-1500rpm离心3-20min，弃上清，添加pH为6-8、1-20mM的PBS重悬；对肥大细胞进行不同药物浓度梯度刺激或使用不同激光波长辐照后培养1-24h，离心取上清储存于离心管中；

（2）SERS光谱检测细胞脱颗粒组分：

使用制备好的SERS增强基底浓缩胶体溶液增强SERS基底，取（1）中提取的肥大细胞脱颗粒组分与SERS增强基底浓缩胶体溶液等体积混合并摇匀，取出滴加在SERS检测的基底上，自然晾干后利用共聚焦拉曼光谱进行细胞脱颗粒组分SERS光谱检测；

（3）细胞脱颗粒SERS光谱数据处理及特征峰选取：

步骤（2）所获得的肥大细胞脱颗粒组分SERS光谱数据进行五阶多项式拟合抠除荧光背景噪声，再进行光谱强度峰值归一化或面积归一化处理；使用SPSS软件结合主成分分析和线性判别分析处理光谱数据；对光谱数据从400-3000 cm^-1波数范围选取3-4个变化最为显著的谱峰作为肥大细胞脱颗粒程度SERS光谱特征峰；

（4）建立β-氨基己糖苷酶释放率与细胞脱颗粒程度相关性；

使用酶标仪检测经促脱颗粒药物或不同激光波长作用下肥大细胞β-氨基己糖苷酶释放率用于体现肥大细胞脱颗粒程度；β-氨基己糖苷酶释放率作为肥大细胞发生脱颗粒的程度标志，用于检验SERS光谱技术检测脱颗粒组分；SERS光谱特征峰的不同反映脱颗粒组分中不同的生物物质和含量；β-氨基己糖苷酶释放率按照如下公式计算所得：

。

2.根据权利要求1所述一种基于表面增强拉曼光谱检测细胞脱颗粒的方法，其特征在于，步骤（1）所述不同药物刺激包括非特异性刺激物和特异性刺激物；所述非特异性刺激物包括细胞脱颗粒药物C48/80、钙离子载体A23187、P物质或黄蜂毒素；所述特异性刺激物包括细菌、病毒和毒素；所述浓度范围为0.5-100μg/mL或1-500μM。

3.根据权利要求1所述一种基于表面增强拉曼光谱检测细胞脱颗粒的方法，其特征在于，步骤（1）所述不同激光波长辐照具体为利用340-850nm波长的激光辐照1-30min，辐照功率为1-20mW；所述激光为半导体激光器发出。

4.根据权利要求1所述一种基于表面增强拉曼光谱检测细胞脱颗粒的方法，其特征在于，步骤（2）所述SERS增强基底浓缩胶体溶液为银胶溶液或金胶溶液。

5.根据权利要求4所述一种基于表面增强拉曼光谱检测细胞脱颗粒的方法，其特征在于，所述银胶溶液采用盐酸羟胺还原方法制备所得，具体为称取0.01-1g固体硝酸银充分溶解于超纯水，另取1-10mL浓度为0.01-1M的氢氧化钠溶液和1-9mL浓度为0.01-10M的盐酸羟胺混合均匀溶液，快速加入硝酸银溶液，搅拌至溶液为均匀乳灰色为止；随后通过高速离心机离心获得，离心转速和时间分别为6000-15000rpm和5-20min。

6.根据权利要求4所述一种基于表面增强拉曼光谱检测细胞脱颗粒的方法，其特征在于，所述金胶溶液采用1-20mL浓度为0.1-10mg/mL氯金酸溶于水中并强烈搅拌下加热至沸腾，后加入0.1-10mL 0.1-10wt%柠檬酸钠进行反应，保持沸腾5-30min，待溶液颜色变为葡萄酒色后自然冷却；随后通过高速离心机离心获得，离心转速和时间分别为6000-15000rpm和5-20min。

7.根据权利要求1所述一种基于表面增强拉曼光谱检测细胞脱颗粒的方法，其特征在于，步骤（2）所述SERS检测的基底材料为99.99%铝片、石英、不锈钢、光滑金箔、银箔、MgF₂或CaF₂中的一种。

8.根据权利要求1所述一种基于表面增强拉曼光谱检测细胞脱颗粒的方法，其特征在于，步骤（2）所述SERS光谱检测的激光功率为0.2-20mW，激光激发波长为400-850nm,选取光谱波数范围为400-3000 cm^-1。