[发明专利]基于表面增强拉曼光谱检测细胞脱颗粒的方法

说明书

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种细胞脱颗粒的检测方法，具体涉及一种基于表面增强拉曼光谱检测细胞脱颗粒的方法。包括以下步骤：细胞脱颗粒组分产生并提取、SERS光谱检测细胞脱颗粒组分、细胞脱颗粒SERS光谱数据处理及特征峰选取、建立β‑氨基己糖苷酶释放率与细胞脱颗粒程度相关性。本发明在检测肥大细胞不同程度脱颗粒时，与传统的检测方法即检测β‑氨基己糖苷酶相比，具有一致的结论，但本发明方法具有高效和便捷的检测特性。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种细胞脱颗粒的检测方法，具体涉及一种表面增强拉曼光谱检测细胞脱颗粒的方法。

背景技术

肥大细胞（Mast Cells, MCs）是由骨髓中的多功能造血干细胞在IL-3作用下分化而来并随血液循环迁移到特定部位或组织进行增殖、分化和成熟，最终进入结缔组织中。肥大细胞脱颗粒（Degranulation）是肥大细胞受到特异性抗原刺激物（如细菌、病毒和毒素等）或非特异性刺激物（如C48/80、钙离子载体和黄蜂毒素等）诱发释放出组胺、5-羟色胺、肝素、类胰蛋白酶、细胞因子和生长因子等颗粒的重要分子事件，其将直接影响次级效应细胞（如嗜酸性粒细胞和中性粒细胞）的募集和激活，引起如炎症疾病、免疫疾病等的发生。近年来，有研究报道肥大细胞在肿瘤发生时可能促进或抑制血管生成，这对癌症的研究尤为重要。肥大细胞脱颗粒中主要有组胺、类胰蛋白酶和β-氨基己糖苷酶等物质。组胺检测步骤繁琐，半衰期短，所需技术要求高；类胰蛋白酶因细胞取样部位差异含量不同导致不易检测；β-氨基己糖苷酶虽半衰期较长，含量相对稳定，但检测时易受样品颜色影响。由于肥大细胞脱颗粒参与多种生物分子事件的发生，故其脱颗粒程度和颗粒物质的检测对了解分子事件发生机制和信号通道调控具有重要意义。

目前用于肥大细胞脱颗粒程度判别和检测分析方法，主要有在体内和体外检测。在体检测方法大多采取确定部位组织制成切片染色，在显微镜下观察肥大细胞胞膜不完整的个数与总细胞数的比值计算脱颗粒比率，此检测过程繁杂、冗长，不宜临床诊断推广。体外检测方法主要有三类：1）脱颗粒物质含量的检测，如组胺、类胰蛋白酶和β-氨基己糖苷酶。这三种分别存在半衰期短和检测繁琐，含量差异大和活性相对较低，受溶液颜色影响等的缺点；2）肥大细胞的外形变化检测，但其存在重现性差、细胞染色失去活性且计数受主观因素影响的不足；3）探针或荧光标记，使用共聚焦显微镜观测。所需检测技术要求高，成本大。所以，迫切需要一种快速、便捷、样品无需预处理，且不受被分析物颜色影响的检测技术用于肥大细胞脱颗粒程度判别和分析的方法。

入射光照到样品时所发生的频率和方向均改变的非弹性散射效应被称为拉曼散射效应。拉曼光谱可提供生物大分子如蛋白质、核苷酸和脂质等成分和构象的化学指纹信息，再通过谱峰归属可反映出物质的分子化学键结构和振动信息，可用于解析分子结构信息。该方法具有快速检测、对样品无损和样品制备简便等优点，可作为一种快速的物质成分分析方法。但是常规拉曼光谱收集到的信号微弱，样品本身荧光背景干扰大，特别在微量浓度样品研究和精密研究分析时，其产生的误差极大，灵敏度远远达不到实际要求。近年来发展起来的表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS）技术不仅克服常规拉曼技术的劣势和不足，同时因借助纳米金属材料如Au、Ag、Cu和Pt等增强基底，从而大大提高了拉曼光谱信号（10⁴-10¹⁴倍）。因此，SERS方法具有对检测所需样品少、对样品无损、高灵敏性、高特异性和有效淬灭荧光等优点，是一种高效、快速的分子结构信息检测分析技术。

发明内容