[发明专利]一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法

权利要求书

1.一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：将全细胞生物催化反应合成的乙偶姻与显色剂混合进行显色反应，测定反应后混合液的OD₅₂₂，并根据乙偶姻标准品的吸光度标准曲线，计算合成样品中乙偶姻含量；

上述方法的具体步骤如下：

（1）全细胞生物催化剂的制备

按体积比1～4‰的比例，将产乙偶姻的能力菌接种于该能力菌生长培养基中，静置培养12～16 h；取活化好的菌液接种于液体生长培养基中，再静置培养至OD₆₀₀为0.4～0.5；按10 mL/管分装培养菌液，在每管培养菌液中加入乳酸链球菌素至其终浓度为15～25 ng/mL，静置诱导4～6 h；离心收集菌体，菌体用PBS缓冲液洗涤1～2次，离心去上清后，再用24mL PBS缓冲液重悬菌体，即得全细胞生物催化剂液体；

（2）全细胞生物催化合成乙偶姻的方法选自如下之一：

A、取1管步骤（1）全细胞生物催化剂液体，离心收集菌体，以该菌体量为全细胞生物催化产生乙偶姻的基准菌体量；再从全细胞生物催化剂液体中分别取6 mL、3 mL、1.5 mL、0.75 mL、0.325 mL、0.1625 mL离心收集菌体，收集的菌体量为基准菌体量的1/4～1/128；另外，用MES缓冲液稀释底物α-乙酰乳酸100倍；取该底物溶液3 mL，分别加入上述离心收集的菌体中，在能力菌培养温度下转化40～60 min；将2 mL转化后反应液转移至离心管中，置于冰水浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，然后离心收集上清液，即得到全细胞生物催化产生的乙偶姻溶液；

B、取步骤（1）全细胞生物催化剂液体，离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体至OD₆₀₀为130～150，制得菌悬液；在60 g蒸煮大豆中加入2～3 mL菌悬液，再添加37.5～50 ng乳酸链球菌素，搅拌混匀后，置于30～40℃下发酵24 h，然后在4～5℃下后发酵24 h；称取发酵大豆10～12 g，充分研磨后转入离心管中，加入10～12 mL灭菌蒸馏水进行超声处理，离心收集上清液，残渣再加入10 mL灭菌蒸馏水超声提取1次，合并上清液，并用灭菌蒸馏水定容至25 mL，即得全细胞生物催化产生的乙偶姻溶液；

（3）制备浓度在0～16 mg/L范围内的乙偶姻标准品溶液，取400 μL乙偶姻标准品溶液与4.6 mL显色剂充分混匀，25～30℃水浴显色反应40～60 min，测定OD₅₂₂值，以乙偶姻浓度为横坐标，OD₅₂₂值为纵坐标绘制标准曲线，制作工作曲线，得到线性回归方程；

（4）乙偶姻产量检测

取步骤（2）全细胞生物催化产生的乙偶姻溶液400 μL与4.6 mL显色剂充分混匀，25～30℃水浴中显色反应40～60 min，立刻在522 nm处测吸光度值；同时设置对照组，即用400μL MES缓冲液代替乙偶姻溶液进行显色反应；样品OD₅₂₂值为样品测量值减去对照组测量值，然后根据步骤（3）乙偶姻标准品的线性回归方程，计算得到样品中乙偶姻含量，其中针对步骤（2）A方法选取OD₅₂₂值为0.8～1.4的样品作为计算样品；

所述产乙偶姻的能力菌为含有α-乙酰乳酸脱羧酶基因的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-ald。

2.根据权利要求1所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：显色剂是按体积比1:1～2:1的比例，将质量体积浓度0.07～0.5%肌酸-NaOH溶液与质量体积浓度0.5～2% α-萘酚-NaOH溶液混合制得，其中肌酸-NaOH溶液是肌酸溶解于0.5～2 mol/LNaOH溶液中制得，α-萘酚-NaOH溶液是α-萘酚溶解于0.5～2 mol/L NaOH溶液中制得，现配现用。

3.根据权利要求1所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于，底物α-乙酰乳酸的制备如下：按体积比55:40:5的比例，将NaOH溶液、灭菌蒸馏水和α-乙酰氧基-α-甲基-乙酰乙酸乙酯充分混匀后，在冰水浴中反应15～20 min制得，其中NaOH溶液的浓度为0.5～2 mol/L。