[发明专利]一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法

说明书

本发明公开了一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，属于生物检测技术领域；本发明将全细胞生物催化反应合成的乙偶姻与显色剂混合进行显色反应，测定反应后混合液的OD₅₂₂，并根据乙偶姻标准品的吸光度标准曲线，计算合成样品中乙偶姻含量；本发明方法具有直观、简便快速、重复性好和检测成本低等特点，适用于工业化应用。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法。

背景技术

乙偶姻（Acetoin，AC），又名为3-羟基-2-丁酮，是一种淡黄色或无色液体，具有令人愉快的奶油香气。根据JECFA（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会）和美国FDA（Food andDrug Administration，食品药品监督管理局）规定，乙偶姻是一种公认安全（GenerallyRecognized as Safe，GRAS）的食品级香料，添加到食物中，可提升食物中的奶香味。同时，乙偶姻是美国能源部优先开发的平台化合物之一，广泛应用于功能材料、手性药物和化学中间体合成等领域。

乙偶姻天然痕量存在于葡萄、草莓、苹果、香蕉、蜂蜜、咖啡和奶酪等食物中，同时是众多微生物的次生代谢产物。在微生物细胞中，糖酵解后产生的丙酮酸，在α-乙酰乳酸合酶作用下生成α-乙酰乳酸，后者在α-乙酰乳酸脱羧酶（Alpha-acetolactatedecarboxylase，Ald）催化作用下生成乙偶姻。目前，ald基因被广泛克隆进大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸乳球菌和丙酮丁醇梭菌等模式微生物中，通过增强ald基因表达，以提高乙偶姻产量（Kandasamy et al., 2016；马红武等，2014；Shen et al., 2016；张显等，2015）。

全细胞生物催化是利用微生物细胞将底物转化为特定产物，其本质是利用微生物细胞内的酶进行催化；相比酶催化，全细胞生物催化免去了酶分离纯化等过程，并且不需要额外提供催化过程中所需要的辅因子，所以有效降低了催化成本、提高了催化效率。构建ald基因和其他基因同时过表达菌株，以这些基因工程菌进行全细胞生物催化反应，不仅能提高反应的稳定性，还能极大提高乙偶姻产量（Kandasamy et al., 2016；Li et al.,2014；李欣等，2017）。

目前，生物产乙偶姻检测方法主要有气相色谱法、蒸馏比色法和高效液相色谱法等，这些方法均较为繁琐复杂。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，在碱性条件下，乙偶姻能与α-萘酚和肌酸制备的显色剂反应生成红色物质，且在一定范围内乙偶姻的量和红色物质颜色的深浅程度成正比关系，可用于比色测定，因此检测OD₅₂₂值的变化就可测定样品中乙偶姻生成的量，即本发明是将全细胞生物催化反应合成的乙偶姻与显色剂混合进行显色反应，测定反应后混合液的OD₅₂₂，并根据乙偶姻标准品的吸光度标准曲线，计算合成样品中乙偶姻含量；该方法具有直观、简便快速、重复性好和检测成本低等特点。

所述显色剂是按体积比1:1～2:1的比例，将质量体积浓度0.07～0.5%肌酸-NaOH溶液与质量体积浓度0.5～2% α-萘酚-NaOH溶液混合制得，其中肌酸-NaOH溶液是肌酸溶解于0.5～2 mol/L NaOH溶液中制得，α-萘酚-NaOH溶液是α-萘酚溶解于0.5～2 mol/L NaOH溶液中制得，现配现用。

上述方法的具体步骤如下：

（1）底物α-乙酰乳酸的制备