[发明专利]一种基于分光光度法的海藻糖含量测定试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种基于分光光度法的海藻糖含量测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

试剂一，液体5mL×1瓶，由海藻糖酶和蒸馏水混合而成，4℃保存；

试剂二，液体25ml×1瓶，由葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林、叠氮钠和磷酸缓冲盐溶液混合而成，4℃保存；

试剂三，液体25ml×1瓶，由重蒸馏酚和蒸馏水混合而成，置于棕色瓶中，4℃保存。

2.根据权利要求1所述的基于分光光度法的海藻糖含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂一中含有的藻糖酶的质量为0.5mg，蒸馏水的体积为5mL。

3.根据权利要求1所述的基于分光光度法的海藻糖含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂二中含有的葡萄糖氧化酶的质量为2mg，过氧化物酶的质量为1mg，4-氨基安替比林的质量为2.5mg，叠氮钠的质量为250mg，磷酸缓冲盐溶液的物质的量为0.1mol/L，pH为7.0，体积为25mL。

4.根据权利要求1所述的基于分光光度法的海藻糖含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂三中所含的重蒸馏酚的质量为25mg蒸馏水的体积为25mL。

5.一种利用如权利要求1所述的试剂盒的基于分光光度法的海藻糖含量测定方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1 仪器和用品的准备；

准备可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿﹑研钵、浓硫酸和蒸馏水；

步骤2 检测前的准备工作；

分光光度计预热30min以上，调节波长至505nm，蒸馏水调零；并且调节水浴锅至95度；

步骤3 工作液的配制；

根据使用需求，将试剂二和试剂三以1:1的比例等体积混合，制得工作液；

步骤4 海藻糖的提取；

从组织中提取：按照组织质量（g）：蒸馏水体积(mL)为（1：5）~10的比例，研磨成匀浆，采用离心率8000g，25℃离心10min，取上清液备用；

从细菌或细胞中提取：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：蒸馏水体积（mL）为（500~1000）：1的比例，超声波破碎细菌或细胞，采用离心率8000g，25℃离心10min，取上清液备用；

从血清或血浆中提取：血清或血浆样品直接检测；

步骤5 海藻糖含量的测定操作；

取2支EP管，分别设定为第一对照管和第一测定管；

在第一对照管中加入100μL样本提取液和200μL蒸馏水，同时在第一测定管中加入100μL样本提取液和200μL试剂一；

分别将第一测定管和第一对照管混匀，在30℃下准确反应15min，再进行90℃水浴5min终止反应，分别获得混合液；

另取2支EP管，分别设定为第二对照管和第二测定管；

在第二对照管中加入100μL由第一对照管中提取的混合液和900μL的工作液；在第二测定管中加入100μL由第一测定管中提取的混合液和900μL的工作液；

分别将第二对照管和第二测定管混匀，置37℃或25℃保温15min后，于505nm波长处分别读取测定管的吸光值A_测定管和对照管的吸光值A_对照管；

计算ΔA = A_测定管 - A_对照管；

步骤6 海藻糖含量的计算；

标准条件下测定回归方程为y = 0.4858x - 0.0042，R2 = 0.9999；

其中，x为标准品浓度，单位为μmol/mL，y为吸光值，y=ΔA；

1）按照蛋白浓度计算：

海藻糖含量(μmol/mg prot)=(ΔA+0.0042)÷0.4858×V_反总÷(V_样×Cpr)÷2=3.088×(ΔA+0.0042)÷Cpr；

2）按样本鲜重计算；

海藻糖含量(μmol/g 鲜重)=(ΔA+0.0042)÷0.4858×V_反总÷(W ×V_样÷V_样总)÷2=3.088×(ΔA+0.0042)÷W；

3）按血清或血浆体积计算；

单位的定义：每mL血清或血浆每分钟催化产生1nmol 葡萄糖定义为一个酶活力单位；

海藻糖(μmol/mL)=(ΔA+0.0042)÷0.4858×V_反总÷V_样÷2=3.088×(ΔA+0.0042)；

其中，V_样=0.1mL，表示加入样本的体积；

V_样总=1mL，表示加入提取液的体积；

V_反总=0.3mL，表示反应体系的总体积；

Cpr表示样本蛋白质的浓度，单位为mg/mL；

W表示样本的质量，单位为g；

500表示细菌或细胞总数500万；

2表示1摩尔海藻糖催化产生2摩尔葡萄糖。