[发明专利]一种基于分光光度法的海藻糖含量测定试剂盒及其方法

说明书

本发明公开了一种基于分光光度法的海藻糖含量测定试剂盒及其方法，该试剂盒包括由海藻糖酶和蒸馏水组成的试剂一，由由葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、4‑氨基安替比林、叠氮钠和PBS组成的试剂二，由重蒸馏酚和蒸馏水组成的试剂三；该方法原理为利用海藻糖酶催化一分子海藻糖产生两分子葡萄糖，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并产生过氧化氢；过氧化物酶催化过氧化氢氧化4‑氨基安替比林偶联酚，生成有色化合物，在505 nm有特征吸收峰，通过测定葡萄糖含量间接反映海藻糖含量。本发明的样本前处理过程简便，检测专一性强，灵敏度高，重复性较好，显色步骤无需加热煮沸，操作更加简便。

技术领域

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种基于分光光度法的海藻糖含量测定试剂盒及其方法。

背景技术

海藻糖广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。由于海藻糖具有独特的不同于其他碳水化合物的生物学特性，因此能在干旱、高温、脱水、冷冻、高渗透压及毒性物质等恶劣环境下保护生物体细胞蛋白质、脂肪、糖类、核酸等组分不受损害。

目前已有的检测海藻糖含量的方法为蒽酮比色法，该方法的缺点为1、专一性不高，易受葡萄糖、果糖、蔗糖等可溶性糖的影响，导致测定结果偏大；2、样本前处理复杂，需要用专用试剂提取，成本较高，因此需要一种样本前处理便捷且专一性较高的海藻糖含量测定方法。

发明内容

为了满足上述需求，本发明旨在提供一种基于分光光度法的海藻糖含量测定试剂盒及其方法，具有样本前处理便捷，检测专一性强，灵敏度高，重复性好，显色操作简便等优点。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种基于分光光度法的海藻糖含量测定试剂盒，包括以下试剂：

试剂一，液体5mL×1瓶，由海藻糖酶和蒸馏水混合而成，4℃保存；

试剂二，液体25ml×1瓶，由葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林、叠氮钠和磷酸缓冲盐溶液混合而成，4℃保存；

试剂三，液体25ml×1瓶，由重蒸馏酚和蒸馏水混合而成，置于棕色瓶中，4℃保存。

进一步的，所述试剂一中含有的藻糖酶的质量为0.5mg，蒸馏水的体积为5mL。

进一步的，所述试剂二中含有的葡萄糖氧化酶的质量为2mg，过氧化物酶的质量为1mg，4-氨基安替比林的质量为2.5mg，叠氮钠的质量为250mg，磷酸缓冲盐溶液（PBS）的物质的量为0.1mol/L，pH为7.0，体积为25mL。

进一步的，所述试剂三中所含的重蒸馏酚的质量为25mg蒸馏水的体积为25mL。

一种利用上述试剂盒的基于分光光度法的海藻糖含量测定方法，其检测原理为海藻糖酶催化一分子海藻糖产生两分子葡萄糖，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并产生过氧化氢；过氧化物酶催化过氧化氢氧化4-氨基安替比林偶联酚，生成有色化合物，在505 nm有特征吸收峰，通过测定葡萄糖含量间接反映海藻糖含量。

本发明首次利用GOD-POD偶联法检测海藻糖含量，其具体步骤如下：

步骤1 仪器和用品的准备；

准备可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿﹑研钵、浓硫酸和蒸馏水；

步骤2 检测前的准备工作；

分光光度计预热30min以上，调节波长至505nm，蒸馏水调零；并且调节水浴锅至95度；

步骤3 工作液的配制；

根据使用需求，将试剂二和试剂三以1:1的比例等体积混合，制得工作液；

步骤4 海藻糖的提取；