[发明专利]一种基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒及方法

权利要求书

1.一种基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

试剂一，液体80mL×1瓶，由盐酸、EDTA、水混合而成；

试剂二，液体10mL×1瓶，由NaOH和水混合而成；

试剂三，液体10mL×1瓶，由盐酸苯肼和水混合而成；

试剂四，液体10mL×1瓶，由磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和水混合而成；

试剂五，α-酮戊二酸标准品0.5mg×1支，置于1.5 mL EP管中，2-8℃保存。

2.根据权利要求1所述的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂一中含有4mL盐酸、5mg EDTA以及76mL水。

3.根据权利要求1所述的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂二中含有80mg NaOH以及10mL水。

4.根据权利要求3所述的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂三中含有80mg 盐酸苯肼以及10mL水。

5.根据权利要求1所述的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂四中含有141.4mg 磷酸氢二钾、51.8mg磷酸二氢钾以及10mL水。

6.一种利用如权利要求1所述的试剂盒的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1 仪器和用品的准备；

准备高效液相色谱仪、耐水C18柱、紫外检测器、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、色谱级甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超纯水；

步骤2 检测前的准备工作；

溶剂的除杂：

将800 mL超纯水和500 mL甲醇分别用0.45μm的水系滤膜和有机系滤膜抽滤，以除去超纯水和甲醇中的杂质，防止堵塞色谱柱；

流动相的配制：

称取1.415g磷酸二氢钾和182.6mg磷酸氢二钾溶于800mL水中，作为流动相A；将纯甲醇作为流动相B；将体积比为95%流动相A+体积比为5%的流动相B相混合配制成流动相；

流动相的消泡：

将配好的流动相超声30分钟，以脱去流动相中的气泡，防止堵塞色谱柱；

步骤3 α-酮戊二酸的提取；

称取约0.2g样本，放入研钵中磨碎，加入0.2mL预冷的试剂一，以及0.5mL预冷的超纯水，移入EP管内，4℃浸提60min，采用10000g离心率，4℃离心10min，提取上清液；

步骤4 α-酮戊二酸的衍生反应；

取250μL步骤3中提取到的上清液，向其中加入50μL的试剂二，200μL试剂三，175μL试剂四，确保体系pH在6.8~7.4之间，25℃下反应30min后，制得样品衍生物溶液，取样待测；

步骤5 α-酮戊二酸标准品溶液的配制；

在试剂五中加入1mL纯水，配成500μg /mL母液，将母液用纯水分别稀释成100μg/mL、50μg/mL、25μg /mL、10μg /mL和5 μg /mL的α-酮戊二酸标准品溶液；将不同浓度的α-酮戊二酸标准品溶液均按照步骤4中的方法进行衍生反应，制得不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品溶液后，分别取样并置于样品瓶内待测；

步骤6 α-酮戊二酸含量测定的操作步骤；

开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10μL，流速1.0 mL/min，柱温25℃，波长325nm，走样时间为50min，设置完毕保存方法组；

用制备好的流动相冲洗色谱柱以及整套高效液相色谱仪的所有管路，待基线稳定后开始加样；

在高效液相色谱仪中，分别加入不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品溶液10μL，在走样时间内分离α-酮戊二酸衍生物，α-酮戊二酸衍生物的保留时间为30min，记录不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品的峰面积，用于计算标准曲线；

在高效液相色谱仪中，加入样品衍生物溶液10μL，在相应保留时间处检测α-酮戊二酸衍生物的峰面积；

步骤6 α-酮戊二酸含量的计算：

以标准品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，计算α-酮戊二酸标准曲线；将α-酮戊二酸衍生物的峰面积代入标准曲线，计算样品中α-酮戊二酸含量。