[发明专利]一种基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种基于HPLC的α‑酮戊二酸含量测定试剂盒及方法，该试剂盒包括由盐酸、EDTA和水组成的试剂一，由NaOH和水组成的试剂二，由盐酸苯肼和水组成的试剂三，由磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和水组成的试剂四以及α‑酮戊二酸标准品；该方法原理为利用α‑酮戊二酸与衍生剂反应产生紫外下有吸收的物质，利用高效液相色谱法分离后，用紫外检测器可测定α‑酮戊二酸的含量。本发明可检测到微克级别的含量，灵敏度高，本发明的样本前处理的过程简单易操作，节约人力，本发明的提取液成分简单，只需水溶液提取，成本低廉，且本发明相对于生物免疫检测方法，所需试剂的价格具有明显优势，且基本无毒，安全环保。

技术领域

本发明属于生命科学领域领域，具体涉及一种基于高效液相色谱法（HPLC）的的α-酮戊二酸含量测定试剂盒及方法。

背景技术

α-酮戊二酸是微生物三羧酸循环中重要的代谢中间产物，是连接细胞内碳-氮代谢的关键节点，在循环中的位置位于异柠檬酸之后以及琥珀酰辅酶A之前。在这一部位，回补反应可以通过自谷氨酸的转氨基作用产生α-酮戊二酸，从而达到补充此中间代谢产物的目的。

目前市面上已有的检测α-酮戊二酸的方法可分为三大类，分光法，生物免疫检测技术以及高效液相检测技术。分光法的原理是利用α-酮戊二酸的衍生物在特定波长下有吸收值进行大概的含量检测，一般极容易受到体系复杂杂质，色素等影响，含很容易出现测试含量偏高。生物免疫检测的方法一来容易受到交叉反应的干扰，二来抗体的不通用性以及制备时间较长，整个时间周期很长，价格昂贵。色谱技术近些年飞速发展，检测生物体内小分子的应用也越来越广泛，但是现在市面上缺少基于高效液相色谱法（HPLC）检测α-酮戊二酸的检测技术却鲜有报道，因此需要一种样品前处理便捷且损失率较高的高效液相色谱法α-酮戊二酸含量检测方法。

发明内容

为了满足上述需求，本发明旨在提供一种基于高效液相色谱法（HPLC）的α-酮戊二酸含量测定试剂盒及方法，具有检测灵敏度高，无毒性，操作简便，成本低廉，重复性较好等特点。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，包括以下试剂：

试剂一，液体80mL×1瓶，由盐酸、EDTA、水混合而成；

试剂二，液体10mL×1瓶，由NaOH和水混合而成；

试剂三，液体10mL×1瓶，由盐酸苯肼和水混合而成；

试剂四，液体10mL×1瓶，由磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和水混合而成；

试剂五，α-酮戊二酸标准品0.5mg×1支，置于1.5 mL EP管中，2-8℃保存。

进一步的，所述试剂一中含有4mL盐酸、5mg EDTA以及76mL水。

进一步的，所述试剂二中含有80mg NaOH以及10mL水。

进一步的，所述试剂三中含有80mg 盐酸苯肼以及10mL水。

进一步的，所述试剂四中含有141.4mg 磷酸氢二钾、51.8mg磷酸二氢钾以及10mL水。

一种利用上述试剂盒的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定方法，其测定原理为利用α-酮戊二酸与衍生剂反应，产生紫外下有吸收的物质，利用高效液相色谱法分离，用紫外检测器可测定α-酮戊二酸的含量，其具体步骤如下：

步骤1 仪器和用品的准备；

准备高效液相色谱仪、耐水C18柱、紫外检测器、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、色谱级甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超纯水；