[发明专利]一种基于Au@NiFe MOFs的双猝灭竞争型电致化学发光传感器的制备方法及应用

权利要求书

1.一种基于Au@NiFe MOFs的双重猝灭型电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）Ru(bpy)₃²⁺/Zr-MOFs的制备

将30 mg ~ 45 mg 2, 2-联吡啶-5, 5-二羧酸溶于12 mL N, N-二甲基甲酰胺中，加入120 μL ~ 360 μL三乙胺，然后加入1 mL ~ 5 mL醋酸，搅拌10 min ~ 15 min得到有机前驱体溶液，将30 mg ~ 50 mg ZrCl₄分散于16 mL N, N-二甲基甲酰胺中，搅拌10 min ~ 15min得到金属溶液前驱体，将两种前躯体溶液混合于50 mL聚四氟乙烯高压反应釜中，70 ℃~ 90 ℃反应24 h，离心分离，用N, N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇分别洗涤数次，35 ℃真空干燥12 h，得到白色固体Zr-MOFs；将18 mg ~ 24 mg Zr-MOFs分散于10 mL乙醇溶液中，搅拌5 min后和10 mL含有1 mg ~ 3 mg的Ru(bpy)₃Cl₂·6H₂O的N, N-二甲基甲酰胺溶液混合，80 ℃ ~ 100 ℃搅拌12 h，N, N-二甲基甲酰胺、乙醇分别洗涤数次，35 ℃真空干燥12 h，得到橙黄色固体Ru(bpy)₃²⁺/Zr-MOFs；

（2）Ru(bpy)₃²⁺/Zr-MOFs标记抗体孵化物溶液的制备

将10 mg的Ru(bpy)₃²⁺/Zr-MOFs分散于1 mL EDC/NHS溶液中室温震荡反应4 h ~ 8 h，超纯水洗去多余EDC/NHS，然后分散到1 mL pH = 7.5的PBS中，加入4 μL ~ 6 μL、6 mg/mL的抗体，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h ~ 24 h，4 ℃离心分离，最后分散于pH = 7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL的Ru(bpy)₃²⁺/Zr-MOFs标记偶联抗体，储存于4 ℃中备用；

（3）纳米多孔材料Au@NiFe MOFs的制备

将140 mg ~ 160 m六水合氯化镍和260 mg ~ 280 mg二水合柠檬酸三钠分散于20 mL超纯水中磁力搅拌5 min，同样将130 mg ~ 150 mg的铁氰化钾分散于20 mL超纯水中磁力搅拌5 min，然后将两种溶液混合继续在室温下搅拌8 h ~ 12 h，离心分离悬浮物，使用超纯水和乙醇分别洗涤2次，35 ℃真空干燥，得到土黄色纳米多孔NiFe MOFs；

将30 mg ~ 50 mg纳米多孔NiFe MOFs分散在50 mL超纯水中，加入1 mL ~ 3 mL 1% ~3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min，加入4 mg ~ 6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70 mg ~ 90 mg还原剂柠檬酸三钠，0.5 mg ~ 1 mg硼氢化钠，室温下搅拌8h ~ 12 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@NiFe MOFs；

（4）Au@NiFe MOFs标记抗原孵化物溶液的制备

将8 mg ~ 12 mg的Au@NiFe MOFs分散到1 mL pH = 7.5的PBS中，加入4 μL ~ 6 μL、6mg/mL的抗原，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h ~ 24 h，4 ℃离心分离，加入1 mL0.5% ~ 0.9%的牛血清白蛋白溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2 h封闭Au@NiFe MOFs上面的非特异性活性位点，4 ℃离心分离，最后分散于pH = 7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5mg/mL ~ 5 mg/mL的Au@NiFe MOFs标记抗原，储存于4 ℃中备用；

（5）分别用1.0 mm、0.3 mm、0.05 mm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；

（6）将6 µL 0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL Ru(bpy)₃²⁺/Zr-MOFs标记偶联抗体滴涂至电极表面，4 ℃晾干；

（7）将3 μL体积分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH = 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；

（8）将6 μL、一定浓度的待测物标准溶液滴加到电极表面，用pH = 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干

（9）将6 μL、0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL的Au@NiFe MOFs标记待测物抗原孵化溶液滴加到电极表面，4 ℃晾干，用pH = 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于Au@NiFe MOFs的双猝灭竞争型电致化学发光免疫传感器。

2.如权利要求1所述制备方法制得的一种基于Au@NiFe MOFs的双猝灭竞争型电致化学发光免疫传感器用于己烯雌酚的检测，其特征在于，检测步骤如下：

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光免疫传感器修饰的玻碳电极为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为500 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 1.4 V，扫描速率为0.1 V/s；

（2）在10 mL、pH 6.0 ~ 8.5的含浓度为1 mmol/L ~ 12 mmol/L三丙胺的PBS缓冲溶液中，通过电化学发光方法，检测对不同浓度的己烯雌酚标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测己烯雌酚样品溶液代替己烯雌酚标准溶液进行测定。