[发明专利]一种基于流式细胞术超高通量分离酿酒酵母单倍体的方法

权利要求书

1.一种超高通量分离酵母单倍体的方法，其特征在于，基于流式细胞术进行分离，所述方法包括如下步骤：

(1)采用蜗牛酶和/或玻璃珠振荡处理孢子悬液；

(2)利用PI和FDA染料对步骤(1)的孢子悬液进行染色；

(3)使用流式细胞仪检测孢子活性；

(4)利用流式细胞仪分选有活性的孢子，直接将单个活性孢子分选到装有固体培养基的高通量孔板中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中是向产孢样品中加入样品质量2～3％的蜗牛酶，28～30℃振荡孵育25～35min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的孢子悬液是通过蜗牛酶处理产孢样品后，添加玻璃珠振荡后得到的；所述玻璃珠振荡具体是：加入占孢子悬液体积35～45％的粒径425～600nm玻璃珠，振荡45～90s，离心去除玻璃珠，收集细胞。

4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，孢子悬液包括二倍体营养细胞、子囊孢子、不同活性的分生孢子。

5.根据权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)将孢子悬液与6～8μg/mLPI染料、3～5μg/mL FDA染料混合，避光孵育15～20min。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，将染色后的样品在488nm下检测荧光信号强度。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将检测后活性孢子细胞群区域最集中的部分设门分选至装有固体培养基的高通量孔板中，每孔分选设定为单个孢子。

8.根据权利要求1～6任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)后对分选的孢子进行配型验证。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述验证是将孢子细胞培养，挑取菌落进行PCR验证菌落配型；PCR所用引物为MAT：5'-AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3'、MAT-a：5'-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3'和MAT-α：5'-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3'。

10.权利要求1～9任一所述的方法在食品、生物领域微生物分离方面的应用。