[发明专利]一种基于流式细胞术超高通量分离酿酒酵母单倍体的方法

说明书

本发明公开了一种基于流式细胞术超高通量分离酿酒酵母单倍体的方法，属于高通量筛选技术领域。本发明通过优化子囊孢子处理条件，得到了酿酒酵母孢子悬液的最佳制备条件。利用PI和FDA染料分别对孢子悬液中活性孢子和失活细胞进行染色，通过基于流式细胞仪分析染色样品，实现了对酿酒酵母孢子的活性区分及孢子的绝对计数。本发明确立了最优的孢子悬液制备条件，建立了基于流式细胞仪的超高通量酿酒酵母单倍体分离技术。

技术领域

本发明涉及一种基于流式细胞术超高通量分离酿酒酵母单倍体的方法，属于高通量筛选技术领域。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在发酵工业中有广泛应用，如酿酒工业、生物能源产业等。同时作为模式生物，其拥有遗传背景清晰、基因操作简便、培养周期较短等优点，在基础研究中也有广泛应用。在发酵工业领域，杂交育种是一种传统、高效的提高酿酒酵母生产性能的育种手段。通过将拥有不同优良性状的单倍体进行杂交，而后分离单倍体，可以筛选得到整合不同优良性状的子代单倍体，提高工业生产性能。在基础研究领域，通过杂交不同表型单倍体细胞，而后分离子代单倍体、进行特定表型分组、全基因组关联分析，可以精确定位与特定表型差异相关的基因型差异。

传统酿酒酵母单倍体分选是利用孢子比营养细胞耐热性高的特点，通过58℃热处理杀死营养细胞，而后涂布YPD平板进行分离。这种方法需要大量的人工操作，且未分散的子囊孢子也能耐受58℃热处理条件，因此传统分离酿酒酵母单倍体的方法存在耗时耗力、分离效率低等问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明建立了一种超高通量分离酵母单倍体的方法，所述方法基于流式细胞术，可在短时间内高效分离大量酵母单倍体菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)制备酿酒酵母孢子悬液；

(2)利用PI和FDA染料对步骤(1)的孢子悬液进行染色；

(3)使用流式细胞仪检测孢子活性；

(4)利用流式细胞仪分选有活性的孢子，直接将单个活性孢子分选到装有固体培养基的高通量孔板中。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括验证孢子生长后单倍体酵母配型。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的孢子悬液可以包括二倍体营养细胞、子囊孢子、不同活性的分生孢子。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的孢子悬液通过蜗牛酶处理产孢样品。

在本发明的一种实施方式中，向产孢样品中加入样品质量2～3％的蜗牛酶，28～30℃振荡孵育25～35min。

在本发明的一种实施方式中，向产孢样品中加入样品质量2.5％的蜗牛酶，30℃振荡孵育30min。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的孢子悬液是通过蜗牛酶处理产孢样品后，添加玻璃珠振荡后得到的；所述玻璃珠振荡具体是：加入占孢子悬液体积35～45％的粒径425～600nm玻璃珠，振荡45～90s，离心去除玻璃珠，收集细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的染色是将孢子悬液与6～8μg/mL PI染料、3～5μg/mL FDA染料混合，避光孵育15～20min。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的染色，具体是：将待分选孢子悬液浓度调整为10⁵～10⁶个细胞/mL，将等体积孢子悬液分别与8μg/mL PI染料、4μg/mL FDA染料混合，避光4℃孵育20min。