[发明专利]人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法及其组合鉴定方法

权利要求书

1.一种人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)选取完整保留角膜及角膜缘组织的标本，放射状切成等份的角膜缘小片；

2)上述角膜缘小片用胶原酶A消化，然后用胰蛋白酶溶液进行消化，然后再接种于包被有Matrigel基质胶的六孔板上，获得原代的LNC；

3)将原代的LNC置于改良的MESCM(modified embryonic SC medium)胚胎干细胞培养液连续培养传代扩增；当LNC的融合度到达80％时，用胰蛋白酶溶液进行消化；

4)采用Matrigel包被塑料培养板表面，MESCM无血清培养基扩增LNC，完成细胞倍增，收获1×10¹⁰细胞，即得到人角膜缘微环境细胞。

2.根据权利要求1所述人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述步骤2)中，胶原酶A消化条件为：温度为35～37℃，CO₂体积分数为5％，消化时间为8～10h。

3.根据权利要求1所述人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述步骤2)中，胰蛋白酶溶液为含有胰蛋白酶Trysin和EDTA的PBS溶液，消化时间为10～20min；其中，胰蛋白酶Trysin的质量分数为5％；EDTA的质量分数为：2～5％。

4.根据权利要求1所述人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述步骤2)中，Matrigel基质胶的体积分数为5％。

5.根据权利要求1所述人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述步骤3)中，改良的MESCM胚胎干细胞培养液中各组分含量如下表，以1ml计：

6.一种权利要求1所述方法制备的人角膜缘微环境细胞的组合鉴定方法，所述组合鉴定方法包含细胞形态学检测、细胞表面标志物检测、细胞多向诱导分化潜能检测和体外支持角膜缘干细胞活性检测共4种方法，其特征在于：

a.细胞形态学检测主要为检测人角膜缘微环境细胞LNC直径，其步骤为：细胞的细胞悬液滴于载玻片上，于倒置显微镜下观察，分别于100X、400X放大倍数下拍照，ImageJ软件手动测量1000个以上细胞的细胞直径，并取平均值，计算其分布特征和；

b.细胞表面标志物检测：利用免疫荧光染色、流式细胞仪、RT-qPCR和激光共焦显微镜；检测的细胞标志物包括Oct4、Sox2、Nanog、Rex1、Nestin、N-cadherin、SSEA4、CD34、CD73、CD90、CD105和SCF；

c.细胞多向诱导分化潜能检测：采用相应的细胞诱导分化培养环境，检测扩增的LNC诱导分化为脂肪、成骨及软骨细胞的效率；

d.体外支持角膜缘干细胞活性鉴定：人角膜缘微环境细胞LNC与角膜缘干细胞LSC共同接种在3DMatrigel立体共培养体系中，观察球形生长现象，第10天获取细胞，采用免疫荧光染色、RT-qPCR及WB检测LSC表达p63α及CK12水平变化。