[发明专利]人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法及其组合鉴定方法

说明书

本发明公开了一种人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法及其组合鉴定方法，该方法先获得角膜缘小片；用胶原酶A消化，然后用胰蛋白酶溶液进行消化，然后再接种于包被有Matrigel基质胶的六孔板上，获得原代的LNC；将原代的LNC置于改良的MESCM胚胎干细胞培养液连续培养传代扩增；采用Matrigel包被塑料培养板表面，MESCM无血清培养基扩增即得到人角膜缘微环境细胞。鉴定方法包含细胞形态学检测、细胞表面标志物检测、细胞多向诱导分化潜能检测和体外支持角膜缘干细胞活性检测共4种方法。本发明分离培养的人LNC细胞，具有明确的形态、抗原、功能特征，可以用于实验研究或者临床移植材料。

技术领域

本发明涉及干细胞培养、鉴定、移植应用领域，具体涉及一种人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法及其组合鉴定方法。

背景技术

干细胞(stem cell)是指能够不断的通过自我更新维持干细胞特性，并能通过定向分化产生正常的功能细胞的一类细胞。1968年Friedenstein描述了一群非吞噬，非造血的成纤维细胞样的细胞，并在随后的研究中发现这群细胞可以在体外形成克隆，并分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉和纤维组织，称作成纤维细胞克隆形成单元(Colony formingunit-Fibroblast，CFU-F)。1991年caplan首次提出间充质干细胞(MSC)的概念¹。2006年提出了定义MSC的最少标准：

1.可以在塑料上生长；

2.高表达特定的标志物CD105，CD73和CD90,并低表达CD45,CD34,CD14/CD11b,CD79a/CD19和HLA-DR；

3.具有自我更新，多向分化潜能及克隆形成能力，可以分化成骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞，肌肉细胞以及非中胚层细胞如神经细胞和肝细胞²。MSC来源于胚胎发育早期中胚层，几乎存在于全身结缔组织^3,4。

MSC最早从骨髓造血微环境分离而来，即骨髓来源的间充质干细胞(Bone marrowderived mesenchymal stem cells，BMMSC)，也可从其他组织器官例如脂肪组织、胎盘、脐带血，羊水，羊膜和多种胚胎组织，包括胚胎的血、肝、骨髓、脾、肺¹等体外分离获得。MSC因其可塑性、低免疫原性、抗炎以及抑制损伤后自身免疫反应¹的功能等被广泛的用于细胞治疗和组织工程，包括造血干细胞移植后免疫重建、移植物抗宿主病(acute and chronicgraft versus host disease，GvHD)、儿童成骨不全(children with OsteogenesisImperfecta，O.I.)、代谢紊乱(metabolic disorders)以及骨与软骨变性(bone andcartilage in degenerative disorders)的组织工程再生^5,6。

BMMSC是造血干细胞的微环境细胞，能够促进和维持造血系统的发生以及造血干细胞的生长和分化，当移植造血干细胞同时移植BMMSC，可以提高造血干细胞移植中20％的成功率⁵。而同样在角膜微环境中，存在着一种类似MSC形态和功能的间充质干细胞⁷，即角膜缘微环境细胞(limbal niche cells，LNC)。

角膜缘微环境细胞(limbal niche cell,LNC)是从角膜缘干细胞(limbal stemcell,LSC)微环境中分离培养出的一群具有血管内皮祖细胞和间质干细胞(MesenchymalStem Cell,MSC)先祖细胞功能的原始细胞，能够在体外3D培养条件下支持角膜上皮细胞先祖细胞(limbal epithelial progenitor cells，LEPC)，表现为LEPC表达P63α增加而CK12降低，因此被命名为角膜缘微环境细胞^7-10。

目前，没有分离培养角膜缘微环境细胞的方法。